Как нормальные, так и больные клетки непрерывно выбрасывают внеклеточные везикулы (ВВ) во внеклеточное пространство, а ВВ несут молекулярные сигнатуры и эффекторы как физиологические, так и патологические.
Внеклеточные везикулы отражают динамические изменения, которые происходят в микроокружении клеток и тканей в состоянии здоровья и на разных стадиях болезни.
ВВ способны изменять функцию клеток-реципиентов.
Было показано, что взаимный обмен молекулярной информацией с помощью внеклеточных везикул между разными органами и типами клеток способствует клеточной трансформации, перепрограммированию, функциональным изменениям и метастазированию.
Внеклеточные везикулы содержат опухолевые супрессоры, фосфопротеины, протеазы, факторы роста, биоактивные липиды, мутантные онкопротеины, онкогенные транскрипты, микроРНК и последовательности ДНК.
Любые ВВ, присутствующие в биологических жидкостях, обеспечивают беспрецедентный неинвазивный доступ к важной молекулярной информации о состоянии клеток, в том числе их мутациям, классификаторам, молекулярным типам, терапевтическим мишеням и биомаркерам лекарственной устойчивости.
Кроме того, внеклеточные везикулы можно использовать для неинвазивной оценки возникновения, прогрессирования, риска, выживаемости и результатов лечения рака.
Цель нашей сегодняшней статьи — осветить современную информацию о роли внеклеточных везикул в развитии онкологических заболеваний и их полезность в диагностике, профилактике и лечении рака.
Новое поколение биомаркеров рака
Живые клетки выделяют во внеклеточное пространство большое количество эндоцитарных или везикул плазматической мембраны, включая экзосомы, микровезикулы (МВ) и апоптотические тела, которые называются внеклеточными везикулами (ВВ).В литературе сообщается о различных названиях внеклеточных везикул — экзосомы, эктосомы, онкосомы, апоптотические тела, микрочастицы или микровезикулы.
В зависимости от происхождения, выделяют два класса ВВ: экзосомы и микровезикулы.
Экзосомы, везикулы размером с наночастицы (30–100 нм) с плавучей плотностью 1,13–1,19 г/см3 , выделяются как здоровыми, так и многими патологически измененными клетками.
Экзосомы образуются по эндолизосомному пути и происходят из эндосомального компартмента, называемого мультивезикулярными телами.
Ли, Парк и соавторы сообщили, что внеклеточные везикулы могут генерироваться мезенхимальными стволовыми клетками и участвовать в подавлении ангиогенеза.
Другие типы клеток, тромбоциты, нейтрофилы, ретикулоциты, макрофаги, мегакариоциты, моноциты, В- и Т-клетки, тучные клетки и эндотелиальные клетки, также выделяют ВВ.
Микровезикулы размером 100–1000 нм образуются путем почкования и слияния плазматической мембраны с внеклеточным веществом и имеют несколько общих черт с родительскими клетками, включая наличие мембранных липидов, рецепторов, многочисленных нуклеиновых кислот и белков.
В целом, молекулярный состав каждой ВВ имитирует родительскую клетку или ткань с ее факторами роста, рецепторами, протеазами, микроРНК, липидами и белками. В нескольких исследованиях сообщалось о наличии ряда биоактивных белков, нуклеиновых кислот, липидов и других биомолекул.
Кейби и соавторы продемонстрировали, что ВВ содержат тетраспанины, такие как CD9, CD63 и CD81; молекулы I и II класса комплекса гистосовместимости (МНС); связанный с лизосомами мембранный белок-2 (LAMP-2).
Внутри экзосом, выделенных из клеток миелоидного лейкоза, колоректального рака и меланомы, присутствует двухцепочечная ДНК (представляющая весь геном опухоли).
Развитие рака — это многоэтапный и многофакторный процесс, который включает неконтролируемый рост, устойчивость к апоптозу, генетические и эпигенетические изменения и отклонения в микроокружении.
Эти изменения внутри раковой клетки отражаются внеклеточными везикулами, поэтому исследователей интересует применение ВВ для диагностики, мониторинга и лечения рака.
Обычно биомаркеры указывают на отклонения от нормального биологического статуса, которые способствуют канцерогенезу. В настоящее время ряд биомаркеров, в основном из циркулирующих клеток рака, применяют для диагностики и дальнейшего лечения.
Многие из современных биомаркеров дают мало информации о происхождении ткани, и поэтому их трудно использовать в таргетной терапии рака. В свою очередь, это значительно ограничивает полезность обычных биомаркеров в научных и клинических условиях.
Уникальные характеристики внеклеточных везикул могут сделать их идеальными биомаркерами следующего поколения для исследований рака и терапии в XXI веке.
Например, участие ВВ во внутриклеточной коммуникации и динамический характер их состава позволили исследователям изучить потенциал модуляции опухоли. Известно, что количество и состав везикул меняются в процессе развития заболевания.
Бейран и соавторы сообщили о повышении количества ВВ у пациентов с опухолью желудка, причем количество везикул коррелировало со стадией. Повышенная экспрессия CCR6 и Her-2 / neu наблюдалась в образцах пациентов с поздней стадией рака.
Уровни PTEN внутри экзосом, выделенных у пациентов с раком предстательной железы, коррелировали с развитием заболевания, а потому их использовали для диагностики рака.
ВВ отличаются превосходным биораспределением и биосовместимостью; эти свойства делают их идеальными для использования при доставке и биораспределении лекарств.
Тот факт, что внеклеточные везикулы содержат функциональные нуклеиновые кислоты, свидетельствует о том, что они функционально похожи на вирусные частицы.
ВВ были обнаружены во многих биологических жидкостях, включая амниотическую жидкость, грудное молоко, бронхоальвеолярный секрет, спинномозговую жидкость и сыворотку крови, слюну и мочу.
Повсеместное распространение везикул в биологических жидкостях наряду с тем, что они отражают состав родительских клеток, дает ученым уникальную платформу для проведения популяционных исследований и изучения онкологических заболеваний.
ВВ могут внести значительный вклад в изучение нормальной физиологии и патофизиологических механизмов.
В эпидемиологических исследованиях сложно, а иногда невозможно собрать несколько биологических образцов до развития заболевания. С помощью ВВ эпидемиологи могут минимально инвазивным путем получить серию необходимых образцов.
Морфологический, молекулярный и функциональный анализ биологических жидкостей, обогащенных ВВ, уже сегодня расширяет наше понимание риска и механизмов развития рака предстательной железы, рака легкого, рака печени, рака желудка, глиобластомы и злокачественных новообразований, связанных с KSHV.
Ряд исследователей работают над использованием внеклеточных везикул в качестве бесклеточной вакцины для профилактики и лечения опухолевых заболеваний.
Функции внеклеточных везикул в организме
Для ВВ были предложены различные биологические роли:- удаление избыточного или вредного клеточного содержимого,
- эмиссия сигнальных и регуляторных молекул для межклеточной коммуникации и функциональной модификации нормальных клеток
- стимуляция или ингибирование иммунной системы организма
- антигенпрезентирующая функция
- контроль патогенов и др.
Можно с уверенностью сказать, что внеклеточные везикулы участвуют как в полезных для организма, так и патологических процессах.
ВВ используются в диагностике и прогнозировании рака, потому что функция исходной клетки может быть экстраполирована путем изучения состава ВВ (белков, мРНК, некодирующих РНК, липидов или других молекул) в жидкостях организма.
Каглерт и коллеги продемонстрировали содержание двухцепочечной ДНК в сыворотке, собранной у пациентов с раком поджелудочной железы. ДНК, выделенная из их везикул, успешно использовалась в лаборатории для выявления мутаций р53 и KRAS.
ВВ не содержат белки митохондриального, ядерного или эндоплазматического ретикулума. Экзосомы, в частности, не содержат большинство рибосомальных РНК, в основном мРНК.
ВВ могут взаимодействовать с клетками-мишенями рака непосредственно через рецепторы клеточной поверхности или могут быть интернализованы клетками-мишенями посредством слияния мембран или эндоцитоза.
Как только ВВ-ассоциированные сигнальные молекулы распознаны, функцию клетки-мишени можно модифицировать или регулировать.
Патологические функции и роль экзосом в изучении рака
В ответ на патологические изменения клетки связываются друг с другом, секретируя гетерогенную смесь везикул (включая МВ и экзосомы) с различным составом.Пегтель и соавторы продемонстрировали, что миРНК, присутствующие в экзосомах из клеток, инфицированных вирусом Эпштейна-Барра, могут высвобождаться и индуцировать сайленсинг специфических генов, когда находятся в контакте с окружающими неинфицированными B-клетками.
Независимо от того, высвобождаются ВВ из клеток инфицированного хозяина или же инфекционного агента, содержащаяся в них информация открывает новые возможности молекулярной диагностики ряда заболеваний.
Анализ содержания везикул также способствует пониманию взаимодействия хозяина с инфекционным агентом, чтобы обеспечить эффективный дизайн вакцины и разработку новых терапевтических средств.
Использование внеклеточных везикул для диагностики рака
Содержание везикул в образцах биологических жидкостей пациента отражает содержание клеток (как стромальных, так и опухолевых), из которых они происходят.ВВ можно использовать в качестве биомаркеров для диагностики, прогнозирования и мониторинга реакции пациента на назначенное лечение.
Было продемонстрировано, по крайней мере, в случае рака яичников, что профилирование миРНК, выделенных из циркулирующих экзосом, дает результаты, аналогичные изучению экзосом непосредственно из ткани.
Это говорит о том, что циркулирующие экзосомы могут быть использованы в качестве суррогата для тканевых миРНК, а профилирование миРНК из экзосом имеет отличные перспективы в качестве диагностического биомаркера рака яичников.
Однако изучение ВВ, характерных для тех или иных заболеваний, только начинается.
Диагностические биомаркеры рака яичников в настоящее время неизвестны, и приблизительно 70% случаев заболевания диагностируются на поздней стадии.
Новая информация свидетельствует, что экзосомные биомаркеры могут быть полезны при скрининге. В частности, количество высвобождаемых из тканей циркулирующих экзосом в четыре раза выше у пациентов с раком яичников, чем у нормальных субъектов.
Лян и коллеги охарактеризовали протеомное и геномное профилирование экзосом рака яичников. Это исследование показало, что в экзосомах присутствуют молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), CD24 и миРНК.
Это содержимое может служить биомаркером для диагностики рака яичников.
Поскольку сообщалось, что сверхэкспрессия EpCAM коррелирует с пролиферацией эпителиальных клеток, при выделении экзосом рака яичника для дальнейшего анализа может быть использована технология на основе микрогранул, покрываемых антителами к EpCAM.
Тейлор и соавторы сообщают, что профилирование экзосомных миРНК является перспективным в плане новых диагностических биомаркеров при раке яичников.
Авторы выявили, что группа присутствующих в экзосомах миРНК (miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-205 и miR-214) обладает характеристиками, аналогичными тем, которые были выделены из ткани яичников.
Кроме того, высокие уровни этих миРНК коррелируют с поздней стадией болезни.
В дополнение к экзосомам, большие диагностические надежды возлагаются на микровезикулы при некоторых злокачественных новообразованиях.
Повышенные уровни микровезикул зарегистрированы в сыворотке крови пациентов с опухолями молочной железы по сравнению со здоровыми людьми.
При раке почки МВ, содержащие разные миРНК и мРНК, высвобождались из стволовых клеток рака почки, что может указывать на их роль в васкуляризации опухоли.
При идентификации биомаркера для мультиформной глиобластомы сывороточные микровезикулы анализировали с помощью микроматричного анализа экспрессии.
Исследователи выявили группу РНК, которые повышены при данном типе опухоли.
Транскриптомный анализ экзосом в моче больных раком предстательной железы показал более высокие уровни PCA-3 и TMPRSS2-ERG по сравнению с контролем.
Поскольку ткань рака предстательной железы фенотипически неоднородная, биопсия, взятая из определенного места, может не отражать общий статус злокачественной опухоли, включая специфические для опухоли варианты, мутации и уровни мРНК и микРНК для диагностических целей.
Транскриптомный анализ циркулирующих везикул может быть репрезентативным для статуса злокачественной опухоли предстательной железы.
Оценка агрессивности рака с помощью внеклеточных везикул
Определение агрессивности рака является ключевым для составления прогноза.Существуют многообещающие возможности использования внеклеточных везикул для этой цели. Например, при раке яичников высокие уровни CD24 указывают на худший прогноз и снижают показатели выживаемости пациентов.
Исследования показали, что уровни EpCAM и CD24, присутствующие в экзосомах, коррелировали с агрессивностью рака яичников.
Рунц выделил экзосомы у пациентов с раком яичников. Исследователь обнаружил, что цитоплазматическая локализация CD24 наблюдается в опухолях с высоким инвазивным потенциалом, и наоборот.
При меланоме экзосомы, выделенные из метастатических клеток, были способны сделать первичную опухоль агрессивной путем конверсии предшественников костного мозга.
Белки, участвующие в регуляции мембранного транспорта и образования экзосом, такие как RAB1A, RAB5B, RAB7 и RAB27A, демонстрируют сверхэкспрессию в клетках меланомы.
При раке мочевого пузыря экзосомы, выделенные из мочи пациентов с поздним раком мочевого пузыря, имели более высокие уровни EDIL-3, молекулы, которая способствует ангиогенезу, по сравнению с экзосомами от здоровых людей.
При гепатоцеллюлярной карциноме было доказано, что EDIL-3, играющий роль в прогрессировании других опухолей, также выделяется в больших количествах.
Рецепторная тирозинкиназа MET отвечает за опосредованное экзосомами метастатическое поведение на модели мышей с меланомой. Когда экспрессия Met в экзосомах уменьшается, прометастатическое поведение клеток костного мозга не наблюдается.
Роль внеклеточных везикул в лечении рака
Как упоминалось ранее, ВВ были предложены в качестве бесклеточной вакцины.Преимущества везикул в заключаются в том, что они не живые объекты и легко экстрагируются из биологических жидкостей.
Это биодоступные носители, которые хорошо переносятся нацеливаются на конкретные ткани, устойчивы к метаболическим процессам и, самое главное, преодолевают мембраны.
ВВ считаются идеальными кандидатами для доставки миРНК / малых интерферирующих РНК или лекарственных молекул, которые в противном случае быстро разлагались бы.
Потенциальные области применения внеклеточных везикул в лечении рака были предложены относительно недавно. ВВ можно снабдить селективной комбинацией лекарств для доставки. При этом вещество достигнет цели с минимальными проблемами, обусловленными иммунитетом и прохождением гематоэнцефалического барьера.
В крови ВВ стабильны и способны доставлять функциональные РНК в клетки.
Что касается персонализированной медицины, ВВ, взятые у одного человека, могут быть обогащены, смешаны с лекарством и возвращены тому же человеку без риска отторжения.
Опухолевые везикулы переносят антигены клеток рака и представляют их Т-лимфоцитам, вызывая противоопухолевый ответ и приводя к массовой гибели опухолевых клеток.
Также было предложено использование ВВ, особенно нановезикул, в бесклеточных противораковых вакцинах. ВВ способны стимулировать иммунную систему к распознаванию специфических антигенов и инициировать иммунный ответ в отношении аномальной раковой клетки, оставляя окружающие клетки неизменными.
Проблемы и потенциальные решения
Хотя концентрация при раке ВВ увеличивается, методы выделения везикул, как правило, отнимают много времени и дают образцы, которые нуждаются в дальнейшей очистке.Эти факторы, наряду с очень высокими затратами, ограничивают применение везикул, особенно в эпидемиологических исследованиях, где анализируются тысячи образцов.
Необходимы дальнейшие улучшения технологии выделения ВВ, очистки и анализа.
Кроме того, современные технологии изоляции затрудняют идентификацию различных подгрупп везикул. Вот почему в научной литературе так часто можно встретить термин «внеклеточные везикулы» вместо конкретных типов (например, экзосомы и МВ).
Существует и другая проблема. Загрязнение комплексами РНК-белок, белковыми агрегатами и другими микрочастицами может повлиять на результаты лабораторных исследований.
Из-за многофункциональной природы ВВ важно понять баланс между здоровой и онкогенной передачей сигналов везикул, что также затруднительно.
Одним из способов использования ВВ в терапевтических целях является удаление / нейтрализация этих пузырьков для предотвращения метастазирования и онкогенеза.
Тем не менее, на сегодняшний день технические и финансовые проблемы, связанные с удалением микроскопических клеточных образований in vivo, мешают клиническому использованию данного метода.
Новые технологические достижения могут изменить ситуацию в ближайшем будущем.
Иногда МВ, высвобождаемые из определенного органа, отвечают за резистентность к терапии, перенося белки множественной лекарственной устойчивости (MDR).
Необходимо понять, как изменить биосинтез внеклеточных везикул и межклеточную коммуникацию, чтобы можно было ВВ использовать для целенаправленной терапии.
Предстоит понять, являются ли методы лечения, которые нацелены на поглощение опухолевых ВВ клетками-реципиентами, достаточно специфическими в контексте предотвращения побочных эффектов.
Также необходимо лучшее понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе биосинтеза везикул и их физиологической значимости.
Несмотря на проблемы, упомянутые выше, научное сообщество заинтересовано в этих тканевых пузырьках и их многочисленных функциях. ВВ имеют большие перспективы для диагностики и лечения рака. Аналогичным образом, существует ряд перспективных направлений использования везикул в исследованиях рака и эпидемиологии.
Константин Моканов: магистр фармации и профессиональный медицинский переводчик
