Раздел медицины:
Онкология

Значимость экспрессии генов семейства GST при раке молочной железы

728 0

Установление ассоциации экспрессии генов семейства GST и клинико-морфологических характеристик у пациенток с отечно-инфильтративным и первично-диссеминированным раком молочной железы

Следует отметить, что в представленных исследованиях при изучении роли глутатион-S-трансферазы (GST) в разивитии химиорезистентности при раке молочной железы (РМЖ) проводилось определение полиморфизма генов GST у пациенток с раком молочной железы, а также иммуногистохимическое определение экспрессии изоферментов GST, однако не проводилось определения экспрессии генов суперсемейства GST.

В связи с данным фактом определена экспрессия генов семейств GST у 37 пациенток, проживающих в Минской области, с установленным в 2009-2013 гг. диагнозом «рак молочной железы cT4NлюбаяM0» - отечно-инфильтративной формой рака молочной железы (ОИФ РМЖ), 74 пациенток, проживающих в Минской области, с установленным в 2009 г. - 1-м полугодии 2014 г. диагнозом «рак молочной железы IV стадии» - первично-диссеминированным раком молочной железы (ПД РМЖ), у которых проводилась цитостатическая терапия с включением антрациклинов на 1-м этапе специального лечения (табл. 8, 9).

В качестве материала для исследования использованы парафинфиксированные срезы образцов опухолевой ткани пациенток.

Таблица 8. Экспрессия генов семейства GST у пациенток с ОИФ РМЖ (сТ4N0-3М0)

mrmj_t8.jpg

Таблица 9. Экспрессия генов семейства GST у пациенток с раком молочной железы с наличием отдаленных метастазов (сТлюбаяТлюбаяМ1, IV стадия)

mrmj_t9.jpg

Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) из парафинфиксированных срезов образцов опухолевой ткани пациенток произведено с использованием набора реагентов «Recover All Total Nucleic acid isolation kit» («Ambion», США). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора «SuperScript III reverse transcriptase, dNTP» и «Ribonuclease inhibitor» («Invitrogen», США).

Полученную в результате обратной транскрипции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) использовали для постановки TaqMan полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с участием «Platinum PCR SuperMix» («Invitrogen», США), специально подобранных пар праймеров и зондов для таргетных генов и референсного гена «домашнего хозяйства» HGUS.

Расчет процента уровня нормализованной экспрессии генов семейства GST проводился по формуле:

2 - (Ct интересующего гена образца - Ct гена HGUS образца) х 100%,

где Ct - пороговый цикл (cycle threshold).

В связи высоким процентом отсутствия экспрессии гена GSTM1 (63,3%) у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ при статистической обработке данный ген рассматривался как номинальный.

При анализе взаимосвязи экспрессии генов семейства GST с гормон-рецепторным статусом опухоли у пациенток с ПД РМЖ (табл. 10) определены статистически значимые различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от эстроген- (p = 0,002) и прогестерон-рецепторного статуса (p = 0,001): так в эстроген- и прогестерон-негативных опухолях отмечена более высокая экспрессия данного гена, чем в эстроген- и прогестерон-позитивных новообразованиях (рис. 21), что согласуется с данными W. H. Peters (1993), L. Gilbert (1993), R. Silvestrini (1997).

Таблица 10. Экспрессия генов GST в зависимости от гормон-рецепторного статуса опухоли у пациенток с IV стадией РМЖ

mrmj_t10.jpg

mrmj_21.jpg
Рис. 21. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от рецепторного статуса опухоли у пациенток с раке молочной железы IV стадии

Следует отметить, что определение экспрессии GSTP1 в данных исследованиях проводилось иммуногистохимическим методом. При этом у пациенток с ОИФ РМЖ данная ассоциация экспрессии гена GSTP1 с гормон-рецепторным статусом опухоли отсутствовала. Для генов GSTM1 и GSTT1 статистически значимых различий в экспрессии у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ в зависимости от рецепторного статуса опухоли выявлено не было.

При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов GST с экспрессией белка Her2neu в опухоли у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ статистически значимых различий в экспрессии в зависимости от рецепторного статуса опухоли выявлено не было. При этом в исследованиях A. Romero и S. Lizard-Nacol также не найдено ассоциации между экспрессией GSTT1, GSTM1 и характеристиками опухолевого процесса, а в исследованиях C. Bellamy, R. L. Franco и J. Huang не выявлено ассоциации экспрессии GSTP1 и онкобелка Her2-neu.

Выявлены статистически значимые различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от молекулярно-генетических подтипов опухоли (рис. 22) у пациенток с ПД РМЖ (p = 0,005).

mrmj_22.jpg
Рис. 22. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от молекулярно-генетических подтипов опухоли у пациенток с ПД РМЖ

Так люминальный подтип опухоли характеризуется низкой нормализованной экспрессией гена GSTP1 (73,22% (9,31-1611,13%)), в то время как при базальноподобном подтипе опухоли наблюдается высокая экспрессия гена GSTP1 (284,87% (15,5-912,61%)). Для других генов семейства GST статистически значимых различия в нормализованной экспрессии генов выявлено не было (p > 0,05).

Полученные данные согласуются с результатами исследования T. Miyake et al., согласно которым люминальный А-, люминальный B- и HER2-позитивные злокачественные новообразования были значительно реже 08ТР1-позитивны (по данным иммуногистохимического метода исследования), чем базальный тип опухолей (р = 0,002, p < 0,001 и р = 0,009 соответственно), и A. Romero et al., в исследовании которых экспрессия GSTP1 статистически значимо ассоциирована с молекулярно-генетическими подтипами (p = 0,0001), при этом низкая экспрессия была отмечена в люминальном А- и В-подтипах, а более высокая - в базальноподобным и Her2neu-позитивном подтипах опухоли.

Интересно, что у пациенток с ОИФ РМЖ различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от гормон-рецепторного статуса, а также молекулярно-генетического подтипа опухоли в нашем исследовании отсутствовали. Таким образом, у пациенток с IV стадией рака молочной железы установлена достоверная сопряженность экспрессии гена GSTP1 более 200% с эстроген- и прогестерон- негативными новообразованиями и триплет-негативным подтипом опухоли (p < 0,05).

При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов ABC, GST с гистологическими параметрами опухоли (ядерный полиморфизм, число митозов на 10 полей зрения, тубулярная дифференцировка, гистологическая степень злокачественности (Nottingham)) статистически значимые различия получены только для гена GSTP1 в зависимости от ядерного полиморфизма в опухоли (высокая экспрессия данного гена наблюдалась при 3 баллах ядерного полиморфизма) (p = 0,032), при этом экспрессия гена GSTP1 не зависела от степени злокачественности опухоли (p > 0,05). Для других генов семейств GST у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ статистически значимых различии в нормализованной экспрессии генов в зависимости от гистологических параметров опухоли выявлено не было (p > 0,05).

Определены статистически значимые различия в экспрессии гена GSTT1 у пациенток с ОИФ РМЖ в зависимости от вовлеченности в опухолевый процесс регионарного лимфатического аппарата (p = 0,037) (табл. 11): при более распространенном опухолевом поражении cN3 отмечена более низкая экспрессия гена GSTT1 (12,76% (0-75,79%)), при этом данная зависимость у пациенток с ПД РМЖ отсутствовала (p > 0,05). В проведенных ранее исследованиях не выявлено взаимосвязи между экспрессией гена GSTT1 и поражением лимфатического коллектора.

Таблица 11. Экспрессия генов семейства GST в зависимости от степени поражения лимфатического аппарата (cN) у пациенток с ОИФ РМЖ

mrmj_t11.jpg

При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов семейства GST с размерами первичного очага (табл. 12) статистически значимые различия в нормализованной экспрессии выявлены для гена GSTP1 (p = 0,041) у пациенток с ПД РМЖ.

Таблица 12. Экспрессия генов GSTв зависимости от размеров первичного очага и поражения регионарных лимфатических узлов у пациенток с раком молочной железы IV стадии

mrmj_t12.jpg

При распространении первичной опухоли на грудную стенку и/или кожу (Т4) отмечена более высокая экспрессия гена GSTP1 (202,1% (9,31-1611,13%)) (рис. 23). Для других генов семейства GST статистически значимых различия в нормализованной экспрессии генов в зависимости от размеров первичного очага выявлено не было (p > 0,05).

mrmj_23.jpg
Рис. 23. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от размеров первичного очага у пациенток с раком молочной железы IV стадии

Полученные данные о более высокой экспрессии гена GSTP1 у пациенток с ПД РМЖ при сТ4 (p = 0,041) находятся в соответствии с результатами исследования B. V. Jardim, в котором продемонстрировано, что высокий уровень экспрессии 08ТР1 (по данным иммуногистохимического метода исследования) был ассоциирован с III стадией и большим размером новообразования (р < 0,05).

При унивариантном анализе ассоциации экспрессии генов GST с общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования заболевания у пациенток с ОИФ РМЖ статистически значимых различий выявлено не было (p > 0,05) (табл. 13).


Таблица 13. Ассоциация экспрессии генов семейства GST с общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования у пациенток с ОИФ РМЖ

mrmj_t13.jpg

При унивариантном анализе влияния экспрессии генов семейства GST на общую выживаемость у пациенток с ПД РМЖ, получавших как часть специального лечения полихимиотерапии (ПХТ) с включением антрациклинов (табл. 14), статистически значимых различий выявлено не было (p < 0,05). Однако обнаружены статистически значимые различия в бессобытийной выживаемости в зависимости от наличия экспрессии GSTM1 (p = 0,0496, относительный риск (ОР) = 0,059, 95%-ный доверительный интервал (ДИ) = 0,35-1,0) (табл. 14).

Таблица 14. Ассоциация экспрессии генов семейства ABC, GST с общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования заболевания у пациенток с IV стадией рака молочной железы

mrmj_t14.jpg

Таким образом, при анализе полученные результатов можно сделать вывод об отсутствии ассоциации экспрессии генов GSTM1, GSTT1 с морфологическими характеристиками опухоли. С точки зрения канцерогенеза представляют интерес данные о наличии взаимосвязи нормализованной экспрессии выявлена гена GSTP1 с отрицательным гормон-рецепторным статусом опухоли, базальноподобным подтипом РМЖ, а также с распространением первичной опухоли на грудную стенку и/или кожу (T4) (p < 0,05) у пациенток с ПД РМЖ, но не с ОИФ РМЖ. Также следует отметить статистически значимые различия в выживаемости без прогрессирования заболевания в зависимости от наличия экспрессии GSTM1 (p = 0,0496, ОР = 0,059, 95%-ный ДИ = 0,35-1,0).

Оценка значимости экспрессии генов семейства GST в течении заболевания у пациенток с отечно-инфильтративным и первично-диссеминированным раком молочной железы

Большое количество научных исследований, направленных на изучение роли GST в формировании химиорезистентности опухоли, не смогли дать однозначный ответ о прогностической значимости данных ферментов в связи со значительным количеством расхождений в полученных научных данных.

Некоторые из этих противоречий могут быть связаны с методологическими вопросами, такими как различия в дизайнах исследований, размерах выборок и методах генотипирования, различия в экспрессии GST в тканях-мишенях или различия в используемых схемах химиотерапии, однако на данный момент предикативная ценность полиморфизмов генов суперсемейства GST продолжает оставаться спорной. Соответственно, вопрос о целесообразности определения экспрессии GST как фактора прогноза течения злокачественного процесса, в частности рака молочной железы, требует дальнейшего изучения.

В связи с вышеизложенным определена экспрессии генов семейств ABC, GST с использованием методики определения уровня нормализованной экспрессии таргетных генов у 37 пациенток с ОИФ РМЖ, 74 пациенток с ПД РМЖ, у которых проводилась цитостатическая терапия с включением антрациклинов на 1-м этапе специального лечения.

Медиана длительности до прогрессирования заболевания у пациенток с ПД РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов, составила 7,5 мес. (от 1 до 62 мес.).

При многофакторном анализе ассоциации экспрессии генов ABC, GST и выживаемости без прогрессирования заболевания у женщин, страдающих ПД РМЖ (табл. 15), установлено, что длительность до прогрессирования заболевания у пациенток, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов, ассоциирована с отсутствием экспрессии гена GSTM1 (p = 0,024), а также со степенью вовлечения в метастатический процесс регионарных лимфатических узлов (cN2-3 против cN0-1) (p = 0,010).

Таблица 15. Многофакторный анализ выживаемости без прогрессирования у пациенток с ПД РМЖ с учетом экспрессии ABC, GST и степени поражения регионарных лимфатических узлов

mrmj_t15.jpg

Таким образом, были выделены факторы риска прогрессирования заболевания у пациенток с ПД РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов:

1. Отсутствие экспрессии гена GSTM1
2. Поражение регионарных лимфатических узлов cN2-3.

На основании данных факторов выделены две группы риска прогрессирования опухолевого процесса из числа пациенток с ПД РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов. Группа умеренного риска прогрессирования включала женщин с отсутствием или наличием только одного из факторов риска.

Группа высокого риска прогрессирования включала пациенток с наличием двух факторов риска и характеризовалась отсутствием экспрессии гена GSTM1 и поражением регионарных лимфатических узлов cN2-3. Выявлены статистически значимые различия в выживаемости без прогрессирования заболевания в группах высокого/умеренного риска (ОР = 2,44, 95%-ный ДИ = 1,40-4,24, p = 0,002) (рис. 24).

mrmj_24.jpg
Рис. 24. Выживаемость без прогрессирования заболевания у пациенток с ПД РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов, в группах высокого/умеренного риска прогрессирования (сплошная линия - высокий риск, пунктирная линия - умеренный риск)

Медиана длительности до прогрессирования заболевания у пациенток с ПД РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов, в группе умеренного риска прогрессирования составила 10 мес. (95%-ный ДИ = 7-20 мес.). Медиана длительности до прогрессирования заболевания в группе пациенток высокого риска составила 5 мес. (95%-ный ДИ = 3-8 мес.).

Далее был проведен анализ влияния выделения данных групп риска на выживаемость без прогрессирования заболевания у пациенток с ОИФ РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов (n = 37). Аналогично были выделены две группы риска прогрессирования опухолевого процесса.

В группу умеренного риска прогрессирования вошли женщины с отсутствием факторов риска или наличием только одного фактора риска. Группа высокого риска прогрессирования включала пациенток с наличием двух факторов риска и характеризовалась отсутствием экспрессии гена GSTM1 и пораженим регионарных лимфатических узлов cN2-3. Установлены статистически значимые различия в выживаемости без прогрессирования заболевания в группах высокого/умеренного риска (рис. 25) (ОР = 3,29, 95%-ный ДИ = 1,19-9,08, p = 0,0214).

mrmj_25.jpg
Рис. 25. Выживаемость без прогрессирования заболевания у пациенток с ОИФ РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов в группах высокого/умеренного риска прогрессирования (сплошная линия - умеренный риск, пунктирная линия - высокий риск)

Длительность до прогрессирования заболевания у пациенток с ОИФ РМЖ, получавших цитостатическую терапию с включением антрациклинов, в группе умеренного риска прогрессирования составила: двадцать пятый перцентиль - 15 мес. (95%-ный ДИ = 11-12 мес.), в группе пациенток высокого риска: двадцать пятый перцентиль - 3 мес. (95%-ный ДИ = 1-15 мес.).

В данном исследовании впервые получены данные о связи между отсутствием нормализованной экспрессии гена GSTM1 и выживаемостью без прогрессирования заболевания, а также риском прогрессирования при проведении полихимиотерапии с включением антрациклинов у пациенток с III и IV стадией рака молочной железы. Точный молекулярный механизм, объясняющий данное явление, остается неясным.

Можно было ожидать, что отсутствие экспрессии GST, а соответственно, и снижение ферментативной деятельности приведет к лучшему ответу на химиотерапию. Однако имеется ряд сообщений, что при нулевых генотипах GSTT1/GSTM1 отмечен более низкий ответ на химиотерапию при различных локализациях неопластического процесса: при остром миелоидном лейкозе, раке яичников, раке молочной железы.

Отсутствие детоксикации электрофильных ДНК-повреждающих агентов может способствовать накоплению генетических изменений в процессе опухолевой прогрессии. Таким образом, отсутствие экспрессии GST может просто отражать биологически отличное, более агрессивное заболевание. Следует отметить, что при исследовании влияния GST на пролиферацию лимфоцитов установлено, что клетки с GSTT1 нулевым генотипом накапливают хромосомные аберрации более интенсивно, чем с GSTT1-позитивным генотипом при воздействии на них мутагенных субстратов.

Имеется гипотеза, что сниженная активность GST и, следовательно, сниженное потребление глутатиона в GST-катализируемых реакциях, приводит к более высокому уровню глутатиона, который блокирует апоптоз и способствует пролиферации опухолевых клеток. Эта гипотеза была впервые предложена Kearns et al. (2001), которые сообщили о наличии связи между повышенным уровнем глутатиона и риском рецидива острого лимфобластного лейкоза у детей. Morales et al. (2005) подтвердили эти результаты, показав, что внутриклеточный уровень глутатиона определяет чувствительность клеток к апоптозу, индуцированному лекарственными препаратами.

Таким образом, на основании определения экспрессии гена GSTM1 и степени поражения регионарных лимфатических узлов у пациенток с РМЖ IV стадии возможно проведение оценки риска прогрессирования опухолевого процесса на фоне проводимого специального системного лечения (полихимиотерапии) с включением антрациклинов для улучшения выработки дальнейшей стратегии ведения пациентов, проведения дифференцированного подхода к спектру диагностических исследований.

Ю.Е. Демидчик, С.А. Костюк, И.Ю. Третьяк
Похожие статьи
показать еще
 
Категории