Раздел медицины:
Онкология

Полимеразная цепная реакция и ее модификации для выявления и изучения ДНК при раке молочной железы

1380 0

Полимеразная цепная реакция

Среди методов, обеспечивших прогресс в молекулярно-биологической диагностике в онкологии, центральное место принадлежит полимеразной цепной реакции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является ферментной реакцией, позволяющей в относительно короткое время (часы) синтезировать миллионы копий выбранных участков дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Количество исходного используемого для амплификации материала может быть мало - от пико- до нанограммов ДНК. ПЦР составляют три повторяющихся последовательных этапа, проводимых в одной пробирке.

Основные стадии ПЦР-анализа:

1. Денатурация - расхождение цепей двойной спирали ДНК, которое достигается при нагревании до 91-95 °С.

2. Отжиг - при снижении температуры до 50-70 °С находящиеся в реакционной смеси праймеры связываются с комплементарным участком одноцепочных ДНК. (Праймеры, короткие олигонуклеотидные затравки длиной 18-30 нуклеотидов, определяют специфичность полимеразной цепной реакции.)

3. Элонгация - при температуре 72 °С фермент Taq-полимераза начинает удлинять праймер, присоединяя к нему нуклеотиды в последовательности, задаваемой ДНК-матрицей. После первого цикла как исходная ДНК, так и ДНК, образованная в ходе ферментативной реакции, служат матрицами на втором и последующих циклах.

Последовательное изменение температурных режимов в специальных термоциклерах (амплификаторах) при достаточном количестве праймеров и нуклеотидов обеспечивают увеличение концентрации исследуемых участков ДНК в несколько миллионов раз за 30-35 циклов.

Изменения в последовательности ДНК могут являться следствием полиморфизма или мутаций.

Данные особенности генома могут служить ДНК-маркерами того или иного патологического состояния и могут быть проанализированы с использованием следующих методик:

1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов - RFLP;

2. Аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR), аллель-специфичная олигонуклеотидная гибридизация (ASO-H);

3. Анализ вариаций в количестве тандемных повторов в ДНК - VNTR (микросателлитный анализ).

В основе методов групп 2 и 3 лежит полимеразная цепная реакция.

Техника RFLP включает экстракцию ДНК, расщепление соответствующими рестриктазами, электрофорез, приготовление, экстракцию, изоляцию, очистку и мечение радиоактивной меткой ДНК пробы, Саузерн-блоттинг, гибридизацию и наконец, ауто-радиографию для визуализации ДНК полос. Саузерн-блоттинг используется для определения размера ДНК-фрагментов после их расщепления рестриктазами и гель-электрофореза. ДНК-фрагменты переносятся на нейлоновую мембрану для реакции с меченой пробой, что позволяет визуализировать полосы ДНК и определить молекулярный вес фрагментов.

RFLP сегодня вытеснена методиками, в основе которых лежит ПЦР, поскольку RFLP требует длительного времени на проведение и использования радиоактивных меток для визуализации полос ДНК.

Аллель-специфичная ПЦР основана на том, что только олигонуклеотиды, последовательность которых абсолютно соответствует исследуемой последовательности, способны связываться с матрицей. Данная методика адаптирована для выявления точечных мутаций в онкогенах (например, точечных мутаций онкогена ras). В данной технологии праймеры конструируются таким образом, что они комплементарны или дикому, или мутантному типу гена, в реакции участвует также общий праймер.

Поскольку у ДНК-полимеразы отсутствует 3'-экзонуклеазная активность, она не способна исправить однонуклеотидное несоответствие между праймером и матрицей на 3'-конце ДНК-праймеров. Таким образом, если олигонуклеотидные праймеры сконструированы так, что содержат несоответствия с одной из матриц (дикой или мутантной) вблизи или на 3'-конце, то не будет происходить элонгации. Поэтому амплифицироваться будет только та матрица, которой соответствует последовательность праймера.

Долгосрочная (long-range) ПЦР была разработана в связи с тем, что размер фрагмента ДНК, амплифицируемого термостабильной полимеразой, ограничен, а именно, для геномной ДНК максимальная длина амплифицированного фрагмента составляет 3-4 кб. В основе данного ограничения лежит частота ошибок Taq-ДНК-полимеразы, которая составляет 2х10-4 - 2х10-5 мутаций на нуклеотид в одном цикле.

Включение ошибочного нуклеотида способствует задержке элонгации, что приводит к тому, что Taq-ДНК-полимераза покидает цепь. Чем длиннее фрагмент, тем больше вероятность включения ошибочного нуклеотида. Было показано, что включение в реакцию фермента, который способен исправлять ошибки Taq-ДНК-полимеразы, способствует тому, что нуклеотидные несоответствия устраняются и Taq-ДНК-полимераза способна дольше удерживаться на матрице, следовательно, можно получить продукт амплификации большей длины. Использование комбинации ферментов позволяет добиться амплификации матрицы геномной ДНК до 22 кб.

Метод нашел применение в мониторинге структурных изменений в митохондриальной ДНК (мхДНК), быстрой амплификации и картировании областей хромосомных транслокаций, амплификации протяженных зон тринуклеотидных повторов.

При проведении долгосрочной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (long-range обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)) используют исправляющий фермент на этапе элонгации ДНК. Метод применяется в выявлении делеций в экзонах, используется для предварительного обогащения ДНК матриц перед другими тестами выявления мутаций.

Анализ вариации в нуклеотидной последовательности методом твердофазного мини-секвенирования (ТМС) разработан для анализа ДНК фрагментов, которые отличаются друг от друга нуклеотидами в одной или нескольких позициях. В данном методе не используется гель-электрофорез. ТМС включает этап амплификации с использованием одного биотинилированного и одного небиотинилированного праймера.

Продукты амплификации наносятся на подложку, на которой иммобилизованы авидин- или стрептовидин-ловушки. Цепи ДНК, которые несут биотиновую метку праймера, взаимодействуют с ловушками и оказываются связанными с подложкой. Нуклеотид в вариабельном сайте детектируется на иммобилизованном ДНК-фрагменте в реакции элонгации праймера: праймер этапа детекции взаимодействует с матрицей ДНК прямо около вариабельного сайта, который анализируется, ДНК-полимераза включает меченый нуклеотид. Если имеет место различие в нуклеотиде в исследуемой позиции полинуклеотидной цепи образцов, то количество включенных разных меченых нуклеотидов будет отличаться.

Количество включенной метки учитывается и служит специфическим индикатором присутствия того или иного нуклеотида в вариабельном сайте (рис. 1).

mrmj_1.jpg
Рис. 1. Принцип метода твердофазного мини-секвенирования

ТМС используют для оценки множественных мутаций, которые могут быть причиной генетической патологии, для анализа аллельных вариаций при исследовании генетического сцепления, для идентификации личности. Метод хорошо подходит для анализа большого количества образцов, поскольку он предполагает простые манипуляции и результат получается как объективная числовая величина, которую легко интерпретировать. Более того, ТМС позволяет проводить количественную детекцию последовательности с тем или иным вариантом нуклеотида в вариабельной позиции, которая присутствует в количестве менее чем 1% в образце.

Метод ТМС применяют для количественного анализа точечных мутаций в опухолевых клетках, присутствующих в минорных количествах в клеточной популяции и для анализа гетероплазматических мутаций митохондриальной ДНК. Несмотря на высокую чувствительность метода, основное его ограничение - способность детектировать только вариабельные нуклеотиды в позициях, прилегающих к праймерам детекции. Для исследования мутаций широко используется метод секвенирования, который универсален.

Тест усечения длины белка (protein truncation test (PTT)) представляет собой метод синтеза белка in vitro. Используется для скрининга мутаций в кодирующем регионе гена, которые вызывают терминирование мРНК-трансляции. На начальном этапе выделяют ДНК или РНК. Затем используются полимеразную цепную реакцию для амплификации ДНК матрицы, обычно размером 1-3 кб, которая затем анализируется в тесте in vitro транскрипции и трансляции. Усеченные протеины идентифицируются натрий-додецил-сульфат-полиакриламидным гель-электрофорезом (SDS-PAGE) и ауторадиографией или флюорографией.

Единичный обширный экзон гена может быть амплифицирован прямо с геномной ДНК, причем амплификация гена происходит, начиная с разных фрагментов гена, которые перекрываются между собой. Полная кодирующая последовательность большого гена, включающая множество малых экзонов, может быть амплифицирована, начиная с нескольких перекрывающихся фрагментов, методом ОТ-ПЦР, с рибонуклеиновой кислотой (РНК) матрицы.

Амплификация гена, начиная с нескольких фрагментов, которые перекрываются на 300-500 п. о., увеличивает чувствительность метода. В таком случае получается, что мутация, расположенная вблизи 3'-конца одного фрагмента, оказывается расположенной вблизи 5'-конца другого перекрывающего фрагмента, что увеличивает вероятность идентификации усеченного протеина.

Для проведения PTT требуется специально модифицированный forward-праймер. В дополнение к основной ген-специфичной последовательности праймеры содержат на 5'-конце Т7-промотор для РНК-транскрипции Т7-РНК-полимеразой, а также эукариотическую консенсусную последовательность для инициации трансляции белка и ATG-фрагмент для начала трансляции белка. Выход и специфичность ПЦР-амплификации оценивается электрофорезом в агарозном геле.

Аликвоты продукта полимеразной цепной реакции используются в качестве матриц для in vitro транскрипции и трансляции, с использованием РНК-полимеразы. В транслируемый протеин включаются меченые аминокислоты (радиоактивная или флуоресцентная метки), что позволяет детектировать результаты исследования автоматически.

Детекция белка, размер которого короче, чем полноразмерный протеин, свидетельствует о присутствии терминирующей трансляцию мутации. Размер укороченного белка говорит о позиции терминирующего стоп-кодона. Подтверждается наличие мутации в ДНК методом секвенирования.

Идентифицированные мутации - это преимущественно мутации сдвига рамки считывания и нонсенс-мутации, но также могут детектироваться мутации, которые нарушают нормальный сплайсинг экзонов.

Существует два основных преимущества PTT по сравнению с другими методами выявления мутаций:

1. Фрагменты гена в несколько килобаз могут быть быстро исследованы в одной реакции.

2. РТТ определяет только те мутации, которые оказывают ясный патологический эффект на функцию протеина (те, что приводят к укорочению длины белка и в большинстве случаев к потере функции белком). Миссенс-мутации и нейтральные полиморфизмы не выявляются.

Если целью исследования является определение миссенс-мутаций, то применяется SSCP (метод конформационного полиморфизма однонитевых молекул ДНК).

Метод РТТ применяется для анализа терминирующих трансляцию мутаций генов BRCA1, BRCA2 при синдроме рака груди и яичников. BRCA1 и BRCA2 подобны по структуре, оба являются протяженными генами со множеством экзонов, в обоих случаях множество мутаций могут приводить к терминации трансляции. Примерно 86% мутаций, выявленных в гене BRCA1, приводят к укорочению белка и порядка 50% из них расположены в экзоне 11. BRCA2 несет 26 кодирующих экзонов. Практически все мутации в BRCA2 приводят к укорочению белка-продукта данного гена.

Таким образом, PTT может рассматриваться как простой, быстрый и экономичный метод скрининга протяженных генов с большим количеством мутаций, результатом которых является преждевременная остановка трансляции.

Гель-электрофорез, чувствительный к конфирмации фрагментов (conformation-sensitive gel electrophoresis - CSGE)

Впервые метод описан Ganguly et al. в 1993 г. Данная технология стала результатом поиска быстрого нерадиоактивного метода гетеродуплексного анализа для скрининга мутаций. Метод основан на разнице в миграционной способности ДНК-гетероду-плексов по сравнению с ДНК-гомодуплексами в ходе электрофореза в полиакриламидном геле при умеренных денатурирующих условиях. Окраска бромистым этидием и визуализация в ультрафиолете позволяют выявить образцы с измененной структурой. Данные образцы подвергаются ДНК-секвенированию для определения природы нуклеотидных изменений.

ДНК-гомодуплекс отличается от ДНК-гетеродуплекса полнотой формирования пар А-Т и G-С согласно модели Уотсона-Крика. ДНК-гомодуплекс представляет собой молекулу ДНК, полностью сформированную согласно принципу комплементарности. Напротив, ДНК-гетеродуплекс сформирован при неполном соответствии модели Уотсона-Крика. Образование пар нуклеотидов не в соответствии с принципом комплементарности может быть вызвано нуклеотидной заменой и приводит к формированию ДНК-гетеродуплекса, что детектируется CSGE.

Обязательным условием проведения CSGE является использование умеренно денатурирующих растворителей в ходе электрофореза в полиакриламидном геле для усиления конформационных изменений, которые вызваны однонуклеотидными изменениями матрицы. При неденатурирующих условиях незначительные конформационные различия, которые обусловлены однонуклеотидными несоответствиями ДНК-фрагментов, будут практически незаметны, и электрофоретическая подвижность ДНК-фрагментов с данными изменениями будет соответствовать электрофоретической подвижности ДНК дикого типа.

При умеренно денатурирующих условиях одно из несоответствующих оснований выворачивается во вне из двухцепочечной структуры ДНК и формирует структуру наподобие петли. Миграционная способность такой молекулы ДНК отличается от миграционной способности ДНК дикого типа при электрофорезе в полиакриламидном геле при умеренно денатурирующих условиях.

Если денатурирующая способность компонентов геля превышает оптимум для CSGE, то оба нуклеотида, формирующие пару вне соответствия с принципом комплементарности, выворачиваются во вне из ДНК-спирали, при этом петля не формируется. В результате гомодуплексная ДНК и гетеродуплексная будут иметь одинаковую электрофоретическую подвижность. Было показано, что фрагменты с инсерциями/делециями, а также с множественными сайтами нуклеотидного несоответствия движутся в геле медленнее, чем дикого типа при умеренно денатурирующих условиях.

Метод используется для анализа изменений в последовательности ДНК многих генов, включая изучение приобретенных мутаций в генах c-kit и BRCA1, BRCA2.

Если исследуется дикая и мутантная ДНК, то проводится амплификация обоих матриц с использованием праймеров, которые полностью ограничивают исследуемый фрагмент. После проведения амплификации следует этап формирования гомо- и гетеродуплексов. ДНК-гетеродуплексы формируются при взаимодействии цепей дикой и мутантной ДНК, которые содержат несопряженные нуклеотиды.

Метод формирования гетеродуплексов представляет собой простой процесс, включающий две стадии: фазу денатурации, на которой формируются одноцепочечные фрагменты ДНК. Во второй фазе происходит аннигиляция, когда ДНК вновь возвращается к двухцепочечному состоянию, когда каждая из смысловых последовательностей формирует пары с различными антисмысловыми последовательностями. В результате формируются как гомодуплексы - полное следование принципу комплементарности (A-T, G-C), так и гетеродуплексы, когда нуклеотиды образуют пару не в соответствии с принципом комплементарности (рис. 2).

mrmj_2.jpg
Рис. 2. Формирование гетеродуплекса при смешивании дикой и мутантной ДНК

До формирования гетеродуплексов как в дикой ДНК, так и в мутантной нуклеотиды формируют пары в соответствии с моделью Уотсона-Крика. В сайте мутации дикой ДНК содержится пара нуклеотидов G-C, в мутантной - A-T. В ходе реакции формирования гетеродуплексов формируется как гомо-, так и гетеродуплексная ДНК. В гомодуплексах восстанавливаются структуры дикой (G-C) и мутантной ДНК (A-T).

Гетеродуплексная ДНК формируется при объединении цепей дикой и мутантной ДНК, которые отличаются одним или несколькими нуклеотидами. В данном примере формируется два типа гетеродуплексов, в которых нуклеотиды сайта мутации формируют пары не в соответствии с моделью Уотсона-Крика, а именно G-T и A-C. Поскольку подвижность гетеродуплексов может быть изменена относительно подвижности гомодуплексов при умеренно денатурирующих условиях, то гетеродуплексы могут быть выявлены методом CSGE.

SSCP (метод конформационного полиморфизма однонитевых молекул ДНК). Техника SSCP была впервые описана в 1989 г. Она включает высокотемпературную денатурацию амплифицированных ДНК фрагментов с последующим электрофорезом при неденатурирующих условиях. Фрагменты могут быть визуализированы мечением радиоактивной меткой, серебром, флуоресцентными красителями, бромистым этидием (рис. 3).

mrmj_3.jpg
Рис. 3. Принцип метода SSCP

SSCP основан на склонности одноцепочечной ДНК (ssДНК) при неденатурирующих условиях формировать особую вторичную и третичную структуры, которые зависят от нуклеотидного состава ДНК. Поскольку электрофоретическая подвижность ДНК при неденатурирующих условиях зависит от формы молекулы, такие факторы, как мутации, могут изменять подвижность ДНК. Эффективность детекции ДНК варьируется, наиболее важный параметр - размер фрагмента. Оптимальна чувствительность методики для фрагментов порядка 150 п. н..

ПЦР-SSCP - быстрый, простой и недорогой метод монито-рирования наличия мутаций. Он удобен для начального скрининга амплифицированных фрагментов ДНК на точечные мутации, малые делеции. SSCP может выступать ориентировочным методом для поиска генов-кандидатов опухолевой чувствительности, может применяться, когда абсолютный анализ на мутации не требуется. Для более точного исследования генетических маркеров канцерогенного риска метод может использоваться в комбинации с другими методами.

Фрагментный анализ (cleavase fragment length polymorphism - CFLP)

ДНК-секвенирование считается золотым стандартом ДНК-диагностики и единственным методом, который позволяет непосредственно идентифицировать мутации. Однако он является дорогостоящим и зачастую его невыгодно использовать в клинике, особенно когда большие ДНК фрагменты необходимо исследовать на наличие уже известных или еще не исследованных мутаций.

Также разработано много методов для детекции нескольких определенных клинически значимых мутаций, когда не требуется секвенировать каждый нуклеотид. Первоначально данные методы давали ответ только «да» или «нет» в отношении отличий тестируемой последовательности от референсной. Только несколько методов были способны точно идентифицировать определенные изменения в нуклеотидной цепи, особенно множественного характера.

В третьем поколении методов детекции мутаций и скрининга полиморфизмов был предложен подход, позволяющий точно определять варианты первичной структуры нуклеиновых кислот. Данный метод основан на расщеплении однонитевой структуры ДНК специальным ферментом. При денатурации и ренатурации одноцепочечная ДНК и РНК приобретают трехмерную конформацию, которая является точным выражением нуклеотидного состава. Данный принцип является основой SSCP-анализа и дидезоксидактилоскопического анализа (dideoxy fingerprinting).


В свою очередь метод CFLP является одной из технологий третьего поколения, который использует эндонуклеазу, являющуюся структурно специфичной и представляющую собой нуклеазный домен Taq-ДНК-полимеразы, названную Cleavase I. Данный фермент сконструирован таким образом, чтобы разрезать фрагмент ДНК в месте, где присутствует специфичная трехмерная структура (рис. 4).

mrmj_4.jpg
Рис. 4. Структуры, распознаваемые Cleavase I ферментом

Фермент быстро и специфично разрезает данные структуры, многие из которых образуются на ДНК-фрагменте, иногда временно, в равновесии с альтернативными, характерными для ДНК структурами (рис. 5).

mrmj_5.jpg
Рис. 5. Принцип фрагментного анализа (CFLP)

Таким образом, каждая специфическая последовательность ДНК приводит к формированию коллекции структур, которые являются опознавательным знаком наличия тех или иных мутаций и могут быть детектированы. Более того, метод позволяет анализировать протяженные фрагменты ДНК, превосходящие длину в 2,7 кб, что невозможно сделать другими методами.

Метод CFLP достаточно чувствителен к присутствию малых изменений структуры и может детектировать изменения, вызванные одной или несколькими нуклеотидными заменами, включая миссенс-мутации, с чувствительностью >95% и специфичностью 100%.

Микроанализ (ДНК-чипы) - компактная система, которая содержит большое количество иммобилизованных молекул-ловушек (например, синтетические олигонуклеотиды, ПЦР-про-дукты, протеины, антитела) для связывания строго определенных частиц-молекул (формат адресации). Метод позволяет взять образец неизвестного состава, поместить на платформу для микроанализа и определить, где какая молекула была захвачена. Затем можно получить информацию о характере и количестве захваченных молекул.

Применение микроанализа:

• одновременное определение экспрессии многих генов; выявление одноцепочечных полиморфизмов (SNP); последовательные гибридизации/генотипирование/выявление мутаций;
• изучение экспрессии белков; белок-белковые взаимодействия.

Метод обеспечивает одновременное получение большого количества информации.

Преимущества микроанализа:

• необходим малый объем пробы для детекции (nL);
• минимум реагентов;
• оценка множества биомолекул одновременно; может быть автоматизирован; количественный учет.

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)

SNP - биаллельные однонуклеотидные вариации, которые могут иметь место в геноме с частотой порядка 1 SNP/1000 п. н. Анализ SNP проводится для изучения предрасположенностей к заболеваниям, выявления особенностей течения патологий.

Анализ SNP проводится и в формате микроанализа с использованием ДНК-чипов. В основе микроанализа лежит принцип гибридизации. Следует помнить, что гибридизация не несет 100%-ной специфичности.

Автоматическое генотипирование с использованием технологии ДНК масс-спектрометрии (MassArray™). Обширные проекты, подобные проекту «Геном человека», продемонстрировали еще одно направление генетического анализа - крупномасштабная идентификация и детекция изменений в геноме популяций и индивидов.

Подобная информация способна внести ясность в этиологию ряда заболеваний. Данные исследования проводились и проводятся с использованием ряда методов, включая метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), микросателлитный анализ (short tandem repeats (STR)), анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

Общий принцип масс-спектрометрии - создание, разделение и детекция ионов, находящихся в газовой фазе. Традиционно методы испарения используются для перевода молекул в газовую фазу. Многие биомолекулы, подвергаясь условиям, необходимым для перехода в газовую фазу, теряют свою структуру. Поэтому биомолекулы помещаются в кристаллические структуры, именуемые матриксом.

Данные системы облучаются наносекундным лучом лазера. Энергия лазера приводит к декомпозиции облученного кристалла, образуется облако частиц, из которого ионы экстрагируются электрическим полем. После ускорения ионы движутся в зоне отсутствия поля и достигают детектора. Массы ионов рассчитываются на основании время полета (time-of-flight-TOF), которое длиннее для больших молекул, чем для маленьких (при условии равенства их начальных энергий) (рис. 6).

mrmj_6.jpg
Рис. 6. Схема системы для ДНК MassArray™ метода

Характер спектра зависит от подготовки образца и состава матрикса. Поэтому первые приборы позволяли анализировать только пептиды и протеины. Создание новых матриксов для нуклеиновых кислот позволило детектировать продукты ПЦР.

Реакция олигонуклеотидного удлинения праймеров (primer oligo base extension reaction (PROBE)) разработана специально для оценки генетических полиморфизмов методом масс-спектрометрии. PROBE-формат может быть использован для анализа делеций, инсерций, точечных мутаций, STR, SNP, для анализа гетерозигот. PROBE-анализ проводится после полимеразной цепной реакции и включает процесс удлинения праймеров при фиксированной на твердой фазе матрице в присутствии одного или более дидезоксинуклеотидов (ddNTPs), при этом образуются аллель-специфичные фрагменты (рис. 7).

mrmj_7.jpg
Рис. 7. Схема PROBE-реакции (продукты элонгации различаются по массе на один нуклеотид)

В случае SNP-анализа праймеры для PROBE-анализа располагаются на матрице в сайте непосредственно возле полиморфной позиции. В зависимости от нуклеотидного статуса SNP получается более короткий или более длинный фрагмент. В случае анализа гетерозиготности образуются два продукта (рис. 8).

mrmj_8.jpg
Рис. 8. Результат SNP-анализа (гетерозиготный образец) с использованием PROBE-реакции (два SNP-аллеля дают два четко различимых масс-сигнала)

После окончания реакции оба продукта денатурируют от твердой фазы и анализируются методом масс-спектрометрии.

В случае STR-анализа ddNTP выбираются таким образом, чтобы терминировать ПЦР на первом нуклеотиде, не присутствующем в повторе. Для определения длины CA повтора используется смесь ddG или ddT. Даже неполные повторы, включающие инсерции или делеции, могут быть анализированы данным методом.

mrmj_9.jpg
Рис. 9. Данные микросателлитного анализа (гетерозиготный образец) с использованием PROBE-реакции. Сигналы, отмеченные звездочкой, соответствуют фрагментам прерывания синтеза

На рис. 9 представлен анализ STR гетерозиготного образца человеческой ДНК. Оба аллеля отличаются четырьмя CA повторами. В ходе ПЦР образуется набор фрагментов (отмечены на рисунке звездочкой). В случае гетерозигот, которые отличаются только одним повтором, более короткий аллель дает более интенсивный сигнал, чем более длинный аллель, так как аллельный и фрагментный сигналы сливаются.

Анализ позволяет добиться высокой точности и эффективности, может комбинироваться с технологией микрочипов для анализа большого количества образцов.

Микросателлитный анализ

В настоящее время хорошо известно, что в некодирующих областях генома присутствуют так называемые тандемные повторы. Эти повторы представляют собой последовательности, состоящие из различного количества мономеров. Мономеры, в свою очередь, могут содержать от одного до нескольких десятков нуклеотидов.

Эффективность использования мини- и микросателлитных последовательностей (маркеров) в ДНК-диагностике обусловлена относительно равномерным распределением их на хромосомах и большим разнообразием. Микросателлиты - простые повторяющиеся последовательности длиной 2-6 п. н.

Микросателлиты классифицируются по повторяющимся фрагментам:

AAAAAAAAAAA - моно-(A)11;

GTGTGTGTGTGT - ди-(GT)6;

CTGCTGCTGCTG - три-(СТС)4;

ACTCACTCACTCACTC - тетра-(ACTC)4.

Высокий уровень полиморфизма, обусловленный разницей в количестве повторов мономера микросателлита, стабильность, которую демонстрируют микросателлиты, сделали их хорошим маркером для создания генетических карт с целью идентифицировать локус, изменения в котором могут быть связаны с формированием заболевания.

Для проведения микросателлитного анализа не требуется большого количества биологического материала. В последние годы для обнаружения различных мини- и микро-сателлитных последовательностей стали использовать различные модификации ПЦР (мультиплексная полимеразная цепная реакция, полимеразная цепная реакция с использованием меченых нуклеотидов). Идентификация результата при анализе гомо- и гетерозигот приведена в табл. 2.

Таблица 2. Исследование гомо- и гетерозиготности в микросателлитном анализе

mrmj_t2.jpg

Для проведения микросателлитного анализа для детекции хромосомных делеций (потери гетерозиготности) важно, чтобы была в доступности как опухолевая, так и здоровая ткань в качестве биологического материала. Например, при проведении исследования лимфопролиферативных заболеваний используются В-лимфоциты периферической крови как опухолевая ткань. В качестве контроля можно использовать популяции гранулоцитов или Т-лимфоцитов.

Образцы оцениваются как:

• гетерозигота, отсутствие делеции (два разных аллеля присутствуют как в нормальной, так и в опухолевой тканях);
• гетерозигота, наличие делеции (два аллеля присутствуют в нормальной ткани, но только один присутствует в опухолевой ткани); 
• гомозигота, не информативно (два аллеля одного и того же размера присутствуют как в нормальной, так и в опухолевой ткани).

Когда определен интересующий фрагмент генома, должны быть выбраны подходящие микросателлиты для исследования, или из перечня уже установленных микросателлитов в базе данных, или из новых микросателлитов. Следует отметить, что прямое секвенирование ДНК часто выявляет микросателлиты, последовательности которых затем используются для дизайна фланкирующих микросателлиты праймеров.

Оценка статуса метилирования

Эпигенетическая модификация ДНК - наследственная генетическая модификация, которая не затрагивает первичную структуру молекулы. Метилирование ДНК является наиболее распространенной эпигенетической модификацией.

Было показано, что с помощью избирательного метилирования специфических участков молекулы ДНК осуществляется регуляция множества клеточных процессов:

• эмбриональное развитие;
• хромосомная стабильность;
• структурная организация хроматина;
• транскрипция;
• инактивация Х-хромосомы.

Аномальное метилирование может являться причиной различных заболеваний, в частности раковых.

Метилирование ДНК оказывает влияние на экспрессию генов:

• CpG-островки узнаются специфическими ферментами - метилтрансферазами;
• CpG-островки часто располагаются в промоторных областях генов;
• метилирование промоторной зоны ингибирует экспрессию соответствующего гена.

Методы исследования метилированных состояний, основанные на капиллярном электрофорезе:

• бисульфитное секвенирование - информация для каждого CpG-островка;
• удлинение на одно основание SNaPShot® Multiplex Kit - количественный результат для индивидуального CpG островка;
• фрагментный анализ с помощью метилспецифичной ПЦР -суммарная оценка метилированных состояний;
• фрагментный анализ, основанный на различии в подвижности метилированной и неметилированной ДНК.

Известно, что первичный дефект при раке возникает в геномной ДНК, и одной из форм изменений ДНК при раке является аберрантное метилирование гена. Анализ статуса метилирования CpG-островков промоторных районов в специфических генах может помочь раннему выявлению рака, определению прогноза и предсказанию терапевтического ответа.

Эпигенетические модификации затрагивают клетки опухоли и практически не выявляются в нормальных клетках того же органа, а разница в уровне метилирования может достигнуть нескольких десятков раз. Метилирование может быть обнаружено за несколько лет до клинического диагноза и в настоящее время является наиболее перспективным методом ранней диагностики опухолей.

Примеры генов-супрессоров опухолевого роста, инактивирующихся путем гиперметилирования CpG-островков промоторных зон, приведены в табл. 3.

Таблица 3. Гены-супрессоры опухолевого роста, инактивирующиеся путем гиперметилирования CpG-островков

mrmj_t3.jpg

Целесообразность использования секвенирования для анализа метилированных последовательностей заключается в:

1. Возможности получить информацию для каждого CpG-участка, составляющего CpG-островок.

2. Количественной оценке степени метилирования продуктов.

3. Точности метода благодаря прямой детекции метилированной последовательности ДНК.

Начальным этапом является выделение ДНК. Степень очистки ДНК критична для успешного выполнения бисульфитной конверсии и в дальнейшем ПЦР. Рекомендуется использовать протеиназу К, чтобы убрать белки перед следующим этапом анализа. Далее необходимо проводить бисульфитную конверсию.

mrmj_10.jpg
Рис. 10. Бисульфитная конверсия

Причины проведения бисульфитной конверсии (рис. 10):

1. Метилирование нельзя детектировать в процессе обычной полимеразной цепной реакцией.

2. При обработке бисульфитом неметилированный цитозин превращается в урацил, а метилированный цитозин не меняет свою структуру.

3. Если затем провести ПЦР, то на месте урацила появится тимин, а на месте 5-метилцитозина - цитозин.

4. Обработка бисульфитом превращает эпигенетическую модификацию в генетическое изменение на уровне первичной структуры ДНК, которое можно затем анализировать при помощи полимеразной цепной реакции.

В процессе реакции могут возникать сложности: частичная апуринизация под воздействием слабой кислоты; неполная конверсия, что приводит к получению ложных результатов; перед последующими этапами анализа необходимо тщательно очистить образец от солей и других возможных ингибиторов.

Следующий этап - дизайн праймеров, а затем амплификация. Существует две основные стратегии дизайна праймеров (табл. 4).

Таблица 4. Стратегии дизайна праймеров

mrmj_t4.jpg

После этапа амплификации проводится анализ результатов. Одним из методов анализа является секвенирование, по результатам которого можно судить о степени метилирования образцов ДНК (рис. 11).

mrmj_11.jpg
Рис. 11. Результат секвенирования метилированной и неметилированной матриц

Еще один вариант анализа полученных результатов - фрагментный анализ, также позволяющий быстро оценить степень метилированности данного ампликона (рис. 12). 

mrmj_12.jpg
Рис. 12. Определение степени метилирования методом фрагментного анализа

При этом дизайн праймеров не отличается от такового для бисульфитного секвенирования, прямой праймер должен содержать на конце флуоресцентную метку. Разделение основано на различии электрофоретической подвижности между C и T, фрагменты с высоким содержанием C (метилированные) движутся быстрее в геле, чем фрагменты с высоким содержанием T (неметилированные).

Метод удлинения на одно основание основан на том, что полимераза удлиняет праймер на один меченый флуоресцентным красителем ddNTP с 3'-конца (в смеси отсутствуют обычные dNTP) (рис. 13), после этого проба анализируется с помощью капиллярного электрофореза (GeneMapper® Software). При дизайне праймеров необходимо учитывать, что последний нуклеотид праймера должен располагаться перед CpG-локусом.

mrmj_13.jpg
Рис. 13. Удлинение на одно основание с использованием набора SNaPshot® («Applied Biosystems»)

Метилспецифичная полимеразная цепная реакция (MSP) характеризуется тем, что CpG-мотивы включены в праймеры, проводится дискриминация по парам праймеров, амплификация зависит от статуса метилирования. Рекомендуемые размеры ампликонов от 80 до 175 п. о., оба ампликона должны охватывать одну и ту же последовательность, на 3'-конце праймера должны быть C из CpG или связка CG. Амплификация должна проводиться в разных пробирках, но затем при нанесении на гель или в капилляр их нужно смешивать.

Детекция может проводиться классически - метод гель-электрофореза или по флуоресцентным меткам (рис. 14).

mrmj_14.jpg
Рис. 14. Классическая и флуоресцентная детекция результатов MSP

Для флуоресцентной детекции используют:

• 6-FAM™ dye - метилспецифичный праймер;
• MSPVIC® dye - праймер для неметилированного состояния.

Разделение ампликонов проводят методом капиллярного электрофореза и анализируют с помощью GeneMapper® Software.

Ю.Е. Демидчик, С.А. Костюк, И.Ю. Третьяк
Похожие статьи
показать еще
 
Категории