Раздел медицины:
Онкология

Молекулярная онкология и новые подходы к терапии опухолей молочной железы

2291 0
Идентификация молекулярных механизмов, принимающих участие в возникновении новообразований, позволила изменить характер подходов к поиску новых лечебных средств: если раньше в этой области превалировал эмпирический компонент, то за последние годы попытки терапевтической модификации биологически важных мишеней стали принимать целенаправленный, патогенетически обоснованный характер.

Под онкологической химиопрофилактикой понимается длительный прием нетоксичного лекарственного препарата, который существенно снижает риск возникновения злокачественной патологии (по стилю своего применения онкохимиопрофилактические средства похожи на фармацевтические формы витаминов).

К настоящему моменту уже подведены первые итоги клинических испытаний антагониста эстрогенов - тамоксифена; показано, что регулярное употребление последнего существенно снижает риск возникновения рака молочной железы.

Недостатком тамоксифена является эпизодическое появление побочных эффектов. Сейчас проходят испытания более специфического антиэстрогенового препарата - ралоксифена. Предполагается, что применение ралоксифена не будет сопровождаться отрицательными последствиями. В отношении профилактики рака легкого большие надежды связываются с применением антагонистов ретиноидных рецепторов. Интересными представляются эксперименты на животных, в которых удалось предотвратить возникновении опухолей толстой кишки посредством назначения ингибиторов циклооксигеназы.

Если до 1990-х гг. поиск антираковых химиопрепаратов базировался на феноменологических критериях - например, подбирались вещества, преимущественно поражающие быстроделящиеся клетки, то за прошедшее десятилетие появился принципиально новый алгоритм разработки терапевтических средств. В качестве мишени выбирается не свойство раковой клетки (по понятным причинам оно не может обладать высокой специфичностью), а биологическая молекула (чаще всего фермент), лежащая в основе злокачественной трансформации.

Соответствующие фармацевтические препараты обладают большей эффективностью и избирательностью действия, при этом их токсичность оказывается заметно ниже, чем у традиционных средств. Наилучшим примером служит специфическое ингибирование рецептора ERBB2, играющего ключевую роль в пролиферации клеток опухолей молочной железы. Для этой цели используют как биологические препараты (Herceprin - ЕКВВ2-специфичные антитела), так и химические ингибиторы ERBB2-B тирозинкиназной функции. В данном контексте следует также упомянуть препараты «Rituximab», «Iressa», «GUvec» и др..

Особый интерес вызывают попытки индивидуализации терапии опухолей, основанные на уточнении ее молекулярно-генетических особенностей. Например, хорошие шансы на внедрение имеет тест на микросателлитную нестабильность, который может свидетельствовать не только о наследственном характере заболевания, но и о хорошей чувствительности новообразования к препаратам группы фторпиримидинов (5-фторурацил, кселода и т. д.). Молекулярно-генетические методы в онкологии всегда используются в комплексе (рис. 19).

mrmj_19.jpg
Рис. 19. Протоколы молекулярно-генетической диагностики в нейроонкологии

Интерес вызывают также подходы, направленные на выявление индивидуальной картины метаболизма химиотерапевтических препаратов. В частности, многие опухоли характеризуются гиперэкспрессией фермента тимидинфосфорилазы. Именно в этих случаях представляется оправданным назначение кселоды - нетоксичного предшесгвенника 5-фторурацила. Данное направление медицины пока еще находится на начальных этапах своего развития, однако есть все основания полагать, что молекулярные подходы к индивидуализации противоопухолевой терапии получат дальнейшее развитие в самое ближайшее время.

В настоящее время предпринимаются интенсивные попытки, направленные на выявление предиктивных маркеров противоопухолевой терапии.

Исследования подобного рода ставят две задачи:

1) молекулярно-генетическая характеристика пациента, позволяющая индивидуализировать дозировку препаратов и уменьшить риск появления токсических реакций;
2) мутационный и экспрессионный анализ опухолевой ткани с целью предсказания чувствительности новообразования к лекарственным средствам (рис. 20).

mrmj_20.jpg
Рис. 20. Молекулярные маркеры ответа на противоопухолевую терапию

Результат лечения онкологического заболевания зависит от так называемого терапевтического индекса, т. е. от разницы между ингибирующим воздействием препарата на трансформированные и нормальные клетки. Как противоопухолевые, так и побочные эффекты зависят от активной концентрации препарата в средах организма, что, в свою очередь, определяется индивидуальным набором полиморфных вариантов гена.

Чувствительность опухоли к лекарственному средству определяется приобретенными молекулярными событиями (мутациями, изменениями экспрессии генов), которые отражаются на внутри-опухолевой концентрации препарата, присутствии и доступности соответствующих биохимических мишеней и т. д.

Таблица 7. Молекулярные маркеры эффективности и токсичности противоопухолевой терапии

mrmj_t7.jpg

В табл. 7 обобщены сведения о молекулярных предикторах эффективности и токсичности препаратов, используемых при противоопухолевой терапии.

Несколько полиморфных вариантов генов, ассоциированных с повышенной чувствительностью к цитостатикам, уже идентифицированы. В частности, носители мутантных аллелей гена TPMT плохо метаболизируют меркаптопурин и нуждаются в 10-15-кратном уменьшении дозировки этого препарата. Существенно, что мутации в гене TPMT консервативны, поэтому для определения функционального состояния соответствующего фермента достаточно провести всего три анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Некоторые варианты гена UGT1A1 ассоциированы с повышенной чувствительностью к иринотекану. Лабораторный тест, направленный на выявление подобных индивидов и влекущий за собой необходимость снижения стартовой дозировки препарата на 20-25%, прошел регистрацию FDA. Вероятно, применение метотрексата также требует пересмотра ряда количественных аспектов, в зависимости от полиморфизма гена MTHFR. Носительство мутантных аллелей гена DPD сопряжено с риском летальных реакций в ответ на введение 5-фторурацила.

Химиочувствительность новообразования в заметной степени коррелирует с экспрессией определенных молекул. Избыток мишени 5-фторурцила, тимидилатсинтетазы (TS), приводит к тому, что переносимые дозы препарата могут «насытить» этот фермент и оказываются заведомо неэффективными. Высокая экспрессия DPD ассоциирована с повышенным внутриопухолевым распадом 5-фторурацила, что также негативно сказывается на результате лечения.

Тимидинфосформилаза (ТР) является фактором ангиогенеза, поэтому повышенная экспрессия соответствующего гена ассоциирована с плохим прогнозом. Однако ТР обладает способностью активировать предшественник 5-фторурацила капецитабин, поэтому опухолеспецифическое увеличение активности фермента может способствовать локальному увеличению концентрации цитостатика.

Повышенная экспрессия генов ферментов репарации ДНК позволяет опухоли нейтрализовать воздействие терапевтических средств. Подобный эффект подтвержден для препаратов платины и алкилирующих агентов. Положительный результат при назначении антрациклинов более вероятен, когда в опухоли активирована мишень препаратов этой группы - топоизомераза II-a. Высокая продукция одной из молекул тубулинов, а именно Р-тубулина класса III, может снизить лечебный эффект таксанов и винкаалкалоидов.


Определение состояния рецепторов гормонов и гена HER2 для подбора таргетной терапии рака молочной железы (РМЖ) уже стало классическим примером молекулярной индивидуализации терапии. Назначение ритуксимаба (Мабтеры) и иматиниба (Гливека) также производят исключительно на основании результатов молекулярного теста.

Хорошей воспроизводимостью отличаются работы, выявляющие высокую чувствительность к цетуксимабу (Эрбитуксу) опухолей толстой кишки, содержащих повышенную копийность гена EGFR. Напротив, присутствие мутаций в онкогене KRAS свидетельствует о бесперспективности применения антагонистов EGFR.

Выявление единичных опухолевых клеток посредством молекулярно-биологических методов

Выявление единичных опухолевых клеток в различных тканях и средах организма представляет клинический интерес по целому ряду причин. Во-первых, подобные технологии могут быть направлены на определение риска метастазирования первичной опухоли и, следовательно, на уточнение целесообразности и интенсивности адъювантного лечения.

Во-вторых, выявление диссеминированных злокачественных клеток может оказаться пригодным для мониторинга эффективности послеоперационной терапии, а также для прогнозирования рецидива. И, наконец, в-третьих, на молекулярные методы возлагаются огромные надежды в плане ранней диагностики новообразований.

Объекты исследования, как правило, варьируются в зависимости от локализации опухоли и путей ее метастазирования. Для новообразований в тех органах, которые граничат с окружающей средой, источником биологического материала обычно выступают выделяемые жидкости и среды организма.

Так, разработка методов ранней диагностики рака легкого подразумевает анализ мокроты, толстой кишки - фекалий, мочевыводящих путей - мочи. Исследования опухолей молочной железы обычно включают ткани региональных лимфатических узлов, кровь и костный мозг. При изучении ранних этапов метастазирования новообразований желудочно-кишечного тракта целесообразно анализировать биопсии печени.

Адекватный выбор биологического материала для исследований в значительной мере осложняется разнообразием биологического поведения опухолей. Например, карциномы молочной железы могут метастазировать как лимфогенным, так и гематогенным путем, причем эти альтернативные пути распространения опухолевых клеток зачастую реализуются вне зависимости друг от друга.

Другая критическая проблема - правильный выбор метода молекулярной детекции опухолевых клеток. Наиболее традиционным является применение иммуноцитохимии. К ее достоинствам следует отнести возможность визуальной оценки строения окрашенных клеток, а также пригодность для внедрения в любой морфологической лаборатории. Главный недостаток данного метода - его достаточно высокая трудоемкость.

Для неинвазивной детекции минорных фракций ДНК можно использовать ряд методов в комбинациях и модификациях:

1. Обогащающие:

• фракционирование при выделении; обогащающая гибридизация;
• AS-PCR (аллель-специфичная ПЦР) и Proof-reading PCR;
• Wild-Type Blocking PCR;
• LM-PCR;
• COLD-PCR;
• рестрикционные методы.

2. Высокочувствительные:

• выделение с помощью сорбентов, задерживающих фракции всех размеров;
• ПЦР-амплификация фрагментов минимальной длины (<100 п. о.).

3. Методы ультравысокого разрешения: dPCR.

За последние два десятилетия огромную популярность приобрели подходы, основанные на применении ПЦР. Полимеразная цепная реакция обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Несмотря на подобные характеристики ПЦР большинство современных методик выявления диссеминированных опухолевых клеток осуществляют в два этапа.

На первой стадии производят обогащение биологического образца; для этого применяют как физико-химические методы (например, градиентное разделение клеток на фракции), так и более специфичные подходы, основанные на отборе клеток-мишеней при помощи фиксированных не твердом носителе антител или пептидов.

Непосредственное выявление с помощью полимеразной цепной реакции молекулы-маркера осуществляется лишь на втором этапе опыта. Практически все специалисты сходятся на том, что применявшиеся ранее неколичественные методы выявления диссеминированных клеток вряд ли имеют перспективу внедрения в клиническую практику. Прогресс технологий ПЦР в режиме реального времени (realtime PCR) позволяет разрабатывать подходы к количественному мониторингу опухолевого клона.

Выбор оптимального маркера новообразования считается серьезнейшей проблемой. Наиболее пригодными для этой цели представляются молекулы, которые не встречаются в нормальных тканях организма. Один из примеров - гены вируса папилломы человека (ВПЧ). Действительно, ВПЧ-инфекция может присутствовать лишь на наружных слизистых покровах, а не во внутренних органах и тканях.

ВПЧ обнаруживают в 65-95% случаев при раке шейки матки. Таким образом, обнаружение единичных раковых клеток в региональных лимфатических узлах, основанное на выявлении специфических нуклеотидных последовательностей ВПЧ, является хорошо обоснованным диагностическим подходом.

Другой пример маркера - мутированные онкогены. Например, значительное число опухолей легкого, толстой кишки, поджелудочной железы содержат мутацию в онкогене KRAS. Предполагается, что само по себе выявление мутированного KRAS в нормальных тканях может свидетельствовать о присутствии диссеминированных опухолевых клеток. Тем не менее большинство разрабатываемых подходов основано на выявлении экспрессионных маркеров.

Под такими маркерами подразумеваются молекулы, которые не экспрессируются в норме, но активируются в опухолевой ткани. Однако подобных молекул не существует, так как даже наиболее специфичные для опухолевых клеток гены, например ген теломеразы, проявляют заметную активность при многих физиологических состояниях организма. Большинство методик по выявлению единичных трансформированных клеток основывается не на опухолеспецифических, а на тканеспецифических маркерах. Например, для мониторинга клеток РМЖ используют цитокератин 19, маммоглобин и т. д..

Выявление отдельных опухолевых клеток сопряжено с целым рядом нерешенных технических проблем. В частности, ни один из применяемых подходов (ПЦР, иммуноцитохимия и т. д.) не обладает оптимальным балансом между чувствительностью и специфичность. Помимо этого, ни один из применяемых маркеров не характеризуется достаточной универсальностью.

Существующие опухолевые маркеры можно назвать условно специфичными. Если еще 15-20 лет назад предполагали, что мутации в онкогенах и антионкогенах служат почти безусловным признаком злокачественного фенотипа, то сейчас ученые представили многочисленные доказательства того, что и абсолютно нормальные ткани могут содержать единичные фенотипически неизмененные клетки с онкоассоциированными изменениями последовательности ДНК.

Несмотря на все трудности перспективность работ по поиску достоверных и высокоспецифичных молекулярных маркеров опухолей не вызывает сомнений. В настоящее время перспективным можно считать использование панелей (комбинаций) маркеров вместо одиночных индикаторных молекул.

Развитие молекулярной генетики изменило подходы к клинической лабораторной диагностике в онкологии. Уже сейчас большинство современных онкологических лечебных учреждений обладают широким арсеналом средств, направленных на рутинное применение различных молекулярно-генетических методов.

Ю.Е. Демидчик, С.А. Костюк, И.Ю. Третьяк
Похожие статьи
показать еще
 
Категории