Раздел медицины:
Онкология

Модификации полимеразной цепной реакции для неинвазивной детекции минорных фракций ДНК при раке молочной железы

1307 0

Корректирующая полимеразная цепная реакция (proof-reading PCR - PR-PCR)

Метод разработан для выявления известных мутаций в геномной дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК).

Он отличается от стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) структурой одного из праймеров и использованием ДНК-полимеразы с корректирующей активностью.

Один из праймеров обладает 3'-концом, расположенным возле сайта предполагаемой мутации, 3'-OH группа данного праймера заменена блокирующей группой.

Выявление мутантного и дикого генов зависит от того, устраняется или нет блокирующая группа праймера корректирующей активностью полимеразы в случае несоответствия с матрицей. Удаление блокирующей группы делает возможной прохождение селективной амплификации и создает основы для дифференциации нормального и мутантного генов (рис. 15).

mrmj_15.jpg
Рис. 15. Схематичная диаграмма принципа метода PR-PCR

Как и в стандартной ПЦР, в данной модификации используют два праймера для амплификации, но в PR-PCR 3'-OH группа одного из праймеров заменена блокирующей группой (x), которая не допускает экспоненциальной амплификации в случае присутствия блокирующего терминального нуклеотида на матрице.

Для эффективного удаления блокирующего нуклеотида нужна ДНК полимераза с корректирующей активностью (proof-reading activity). Если блокирующий 3'-нуклеотид не комплементарен матрице, то он будет удален корректирующей активностью полимеразы, допуская, таким образом, прохождение элонгации, т. е. матрица будет амплифицироваться. Если блокирующий нуклеотид связывается с матрицей, то его удаление полимеразой неэффективно и элонгация, а значит и амплификация матрицы блокируется.

Использование данного метода сделало возможным селективную амплификацию специфического ДНК фрагмента при наличии очень малого количества ДНК. Дополнительное преимущество - возможность амплифицировать мутантную последовательность из смешанной популяции мутантных и диких ДНК. Подобное свойство присуще и методу аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (AS-PCR), но у аллель-специфичной ПЦР есть и свои ограничения: при выполнении AS-PCR может происходить ошибочная элонгация праймеров, которые не образуют полностью комплементарной пары с матрицей, что приведет к ошибочному выходу продуктов реакции. Напротив, PR-PCR создает другие альтернативные условия амплификации.

Для обеспечения значимой разницы амплификаций в PR-PCR блокирующий 3'-нуклеотид должен эффективно вырезаться. Избирательное вырезание блокирующего 3'-нуклеотида при условии несоответствия матрице осуществляется в каждом цикле амплификации, поэтому кумулятивный эффект после множества циклов очень высок.

Дополнительное различие в том, что в PR-PCR непосредственная элонгация праймера начинается с потенциального сайта мутации в отличие от начала элонгации с соседнего нуклеотида в случае AS-PCR. Более того, корректирующая способность ДНК полимеразы (используется Pfu-ДНК-полимераза) снижает риск нежелательных мутаций, который всегда присутствует при амплификации, данный риск меньше, чем в случае использования Taq или других термостабильных полимераз, у которых нет корректирующей способности. PR-PCR является высокоселективной методикой при простоте манипуляций.

ПЦР с блокированием дикого типа (wild-type blocking PCR WTB-PCR) - одна из наиболее эффективных технологий обнаружения редких аллелей, содержащих точечные мутации (единичные однонуклеотидные замены или небольшие делеции/инсерции).

Сутью технологии является введение в ПЦР-смесь дополнительных модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных последовательности исследуемого региона ДНК «дикого типа» и имеющих достаточно высокую температуру плавления. В ходе полимеразной цепной реакции эти дополнительные олигонуклеотиды (блокаторы) не отделяются от своей мишени на этапах отжига и элонгации и таким образом препятствуют полимеразному синтезу новых копий ДНК.

Однако при наличии в исследуемом регионе хотя бы одной точечной мутации температура плавления данных олигонуклеотидов значительно снижается, и полимеразный синтез начинает идти беспрепятственно (рис. 16).

mrmj_16.jpg
Рис. 16. Схема принципа метода полимеразной цепной реакции с блокированием дикого типа

Применение WTB-PCR позволяет добиться избирательности не менее 1:2000 при чувствительности менее 5 копий исследуемой ДНК).

Лиганд-опосредованная полимеразная цепная реакция

Лиганд-опосредованная полимеразная цепная реакция (ligand-mediated PCR - LM-PCR) - это метод амплификации ДНК-фрагмента или серии фрагментов с одного сайта отжига праймера. Фрагмент денатурирует и гибридизируется с праймером. Полимераза при элонгации оставляет отрезок полинуклеотидной цепи для соединения с линкерным праймером, который представляет собой двойной олигодезоксинуклеотид, и становится сайтом связывания второго праймера для последующих циклов амплификации.

Полимеразная цепная реакция с коамплификацией при низкой температуре денатурации (co-amplification at lower denaturation temperature PCR -COLD-PCR)

COLD-PCR - технология, которая позволяет детектировать мутации в ДНК, присутствующей в малом количестве. Метод использует критическую температуру (Тс), при которой ДНК с мутациями преимущественно плавится по сравнению с ДНК дикого типа. COLD-PCR обогащает мутантной ДНК смесь дикой и мутантной ДНК. Tc ниже, чем стандартная температура денатурации, при Tc преимущественно денатурируют гетеродуплексные молекулы (те, что сформированы из цепей дикой ДНК и мутантной).


COLD-PCR может быть выполнена в двух форматах: полная (full) COLD-PCR или быстрая (fast) COLD-PCR (рис. 17).

mrmj_17.jpg
Рис. 17. Схема принципа метода полимеразной цепной реакции с коамплификацией при низкой температуре денатурации

Полная COLD-PCR может увеличивать количество копий всех возможных мутаций вдоль последовательности, хотя и в меньшей степени, чем для быстрой COLD-PCR. Полная COLD-PCR использует промежуточную температуру во время ПЦР-циклирования для кросс-гибридизации мутантных и диких аллелей. Гетеродуплексы, которые плавятся при более низкой температуре, чем гомодуплексы, затем селективно денатурируют при Tc и амплифицируются при прохождении циклов ПЦР.

При проведении полной COLD-PCR формирование гетеродуплексов не требуется, умножаются мутации в любой позиции ДНК не все, а те, которые делают Tm мутантного ампликона ниже по сравнению с дикой ДНК (в соответствии с соотношением Tm для пар нуклеотидов: G:C>A:T или G:C>T:A).

Применение COLD-PCR позволяет увеличить количество матрицы с мутациями, таким образом улучшая детекцию и селективность. Чем больше A(Tm-Tc), тем выше выход мутантной ДНК.

COLD-PCR позволяет детектировать менее чем одну мутантную копию на 1000 диких копий ДНК.

Технология имеет различные сферы применения:

• детекция мутаций в малигнизированных клетках крови;
• генотипирование образцов опухоли с низким содержанием малигнизированных клеток;
• детекция мутаций в циркулирующих опухолевых клетках;
• идентификация резистентных клонов в первичных опухолях;
• мониторирование мутаций, вызывающих вирусную резистентность.

COLD-PCR может служить высокоточным и чувствительным методом, необходимым для скрининга онкологических пациентов на ранних стадиях заболевания.

Цифровая полимеразная цепная реакция (digital PCR - dPCR) (Vogelstein и Kinzler, 1998 г.) является оптимизированным вариантом традиционных методов ПЦР. Технология может быть использована для клональной амплификации и количественного учета нуклеиновых кислот (включая ДНК, кДНК, метилированную ДНК или рибонуклеиновая кислота (РНК)).

Ключевое различие между цифровой и традиционной ПЦР заключается в методе количественного учета нуклеиновых кислот. Полимеразная цепная реакция предполагает выполнение одной реакции в одном образце. dPCR также предполагает проведение одной реакции в одном образце, но образец разделен на множество порций и реакция проводится в каждой порции индивидуально. Данное разделение образца на порции позволяет получить более надежную информацию о структуре и составе образца. Метод продемонстрировал свою состоятельность для изучения вариаций в генетических последовательностях - количество копий, точечные мутации.

dPCR позволяет преодолеть трудности традиционной ПЦР. При выполнении dPCR каждый образец разделяется на порции так, что каждая молекула оказывается в собственном домене, в котором и протекает амплификация. Расчеты производятся по методу Пуассона. В результате каждому домену приписывается цифра «0» или «1», в зависимости от того, содержит он молекулу или нет, что соответствует положительной или отрицательной реакции. После прохождения ПЦР-амплификации возможно проводить количественный учет нуклеиновых кислот путем учета регионов, которые содержат конечные ПЦР продукты, положительные реакции (рис. 18).

mrmj_18.jpg
Рис. 18. Схема принципа метода dPCR

В традиционной полимеразной цепной реакции количество нуклеиновой кислоты пропорционально количеству циклов амплификации. dPCR независима от количества циклов амплификации для определения начальной концентрации нуклеиновой кислоты в образце, что является преимуществом метода, так как экспоненциальные данный для количественной оценки нуклеиновых кислот несут некоторую неточность.

dPCR имеет много областей приложения, включая детекцию и количественный учет патогенов, присутствующих в малых концентрациях, выявление редких генетических последовательностей, определение вариаций в количестве копий генетических последовательностей, определение относительной генной экспрессии в единичной клетке, обогащение и разделение смесей молекул.

Преимущества dPCR:

• нет необходимости полагаться на референсные образцы и стандарты;
• желаемая точность может быть достигнута путем увеличения количества ПЦР доменов (повторов);
• высокоустойчива к ингибиторам;
• возможность анализировать сложные смеси молекул;
• в отличие от традиционной ПЦР dPCR предоставляет линейный отклик на количество копий нуклеиновой кислоты в образце, что позволяет детектировать даже незначительные изменения состава образца.

Ю.Е. Демидчик, С.А. Костюк, И.Ю. Третьяк
Похожие статьи
показать еще
 
Категории