Раздел медицины:
Онкология

Гистологическая дифференцировка рака молочной железы и митозы в опухоли

13163 0

Гистологическая дифференцировка рака молочной железы

Гистологическую градацию рака молочной железы (РМЖ) впервые ввел R.B. Greenough из Бостона, который в 1925 г. опубликовал анализ 73 случаев РМЖ.

Несмотря на то что прошло много времени и опубликовано большое количество работ о применении гистологической градации рака молочной железы, ничего существенного не добавлено в перечень морфологических критериев, которые определяют группы РМЖ, имеющие клиническое значение.

Работа R.B. Greenough актуальна и сегодня, он сформулировал прогностически значимые категории инвазивного рака молочной железы низкой, средней и высокой степени злокачественности.

Это деление базируется на 5 признаках:

1) тканевой (гистологической) организации опухоли, то есть способности образовывать дольки, протоки и железистоподобные структуры;
2) степени секреторной активности, которая подтверждается цитоплазматическими вакуолями, капельками муцина в просвете желез;
3) клеточной атипии, то есть единообразии или вариации размеров и формы клеток, соотношении размеров ядра и цитоплазмы;
4) наличии гиперхромных ядер;
5) наличии ядерной атипии и количества митотических фигур.

В соответствии с градациями по Greenough типы рака высокой степени злокачественности имеют клетки и ядра неправильной формы и различного размера, без секреторной функции, клетки расположены столбцами, отмечают гиперхроматоз ядер и большое количество атипичных митозов.

И наоборот, опухоли, состоящие из желез, построенных из единообразных по размеру и строению клеток без гиперхроматоза, с малым количеством митозов, следует относить к РМЖ низкой степени злокачественности.

По данным R.B. Greenough, после радикальной мастэктомии пациентки с раком низкой степени злокачественности были излечены в 68%, умеренной — в 33% случаев и нулевым был результат при высокой.

В 1928 г. Patey и Scarff из Лондона опубликовали анализ 50 случаев рака молочной железы. Они изучили корреляцию между гистологической градацией по Greenough, статусом лимфатических узлов и выживаемостью пациенток. Выявлено, что пациентки с раком низкой степени злокачественности после радикальной мастэктомии излечивались в 85%, средней степени — в 45% и высокой — в 23% случаев.

Кроме того, авторы отметили, что прогноз течения заболевания всегда хороший при отсутствии метастазов в лимфатических узлах, изъязвления опухоли и распространения ее на фасции независимо от гистологической степени злокачественности по Greenough.

Они также сделали заключение, что в случаях нераспространенного РМЖ более продолжительный период ремиссии, то есть период до появления метастазов или рецидивов после радикальной мастэктомии, у пациенток с опухолью низкой степени злокачественности по Greenough, а в случаях распространенного рака — более эффективна паллиативная терапия.

Последующая работа H.J.C. Bloom из Лондона, опубликованная в 1950 г., подтвердила выводы Patey и Scarff. В классическом труде Bloom-Richardson, опубликованном в 1957 г., окончательно сформулированы критерии гистологической градации РМЖ. В своей работе они проанализировали течение болезни 1409 пациенток, из которых 359 прожили более 15 лет.

Подобно R.B. Greenough, исследователи разделили рак молочной железы (РМЖ) на 3 категории, базируясь на трех показателях:

1) относительном количестве тубулярных структур;
2) наличии вариаций размеров клеток рака;
3) количестве гиперхромных ядер и фигур митоза.

Каждый из этих показателей авторы оценили в баллах (1, 2 или 3 балла). Суммируя количество баллов, получим возможные комбинации от 3 до 9. Наименьшее количество баллов соответствует наиболее низкой степени злокачественности рака молочной железы.

Авторы разделили шкалу злокачественности на три части: 3, 4 или 5 суммарных баллов — низкая степень злокачественности (grade 1); 6 или 7 суммарных баллов — средняя (grade 2); 8 или 9 — высокая (grade 3). Эта схема стала наиболее популярной в мире и называется схема градации РМЖ по Bloom-Richardson или технология Scarff-Bloom-Richardson, хотя должна была называться техникой градации по Greenough, в честь человека, впервые опубликовавшего эту градацию в 1925 г.

Bloom и Richardson установили, что 26% из 1409 исследованных случаев РМЖ имели 1-ю степень гистологической злокачественности, 45% — 2-ю, 29% — 3-ю. Результаты сравнения гистологических степеней злокачественности первичной опухоли и метастазов в аксиллярных лимфатических узлах показали, что в 82% степени совпадали.

В 12% случаев степень злокачественности была выше, а в 6% — ниже в метастазе, чем в первичной опухоли. Авторы выявили, что степень гистологической злокачественности, как и статус регионарных лимфатических узлов, дает независимую прогностическую информацию (табл. 2).

Таблица 2. Выживаемость пациенток с РМЖ в соответствии с градационной схемой Bloom-Richardson (исследованы 1409 пациенток).
mrf_t_2.jpg

Bloom и Richardson пришли к выводу, что степень гистологической злокачественности рака молочной железы отражает предполагаемое клиническое течение заболевания и вероятность развития метастазов в дальнейшем, что стало в свое время очень прогрессивным учением.

Очевидно, что степень гистологической дифференцировки имеет корреляцию с темпами роста опухоли и соответственно показателями S-фазы митотического цикла (ЗН-тимидина, Ki67), показателями анеуплоидии, экспрессией С-егВ-2, рецепторов эстрогена и прогестерона.

Важность этого показателя очевидна, однако в ряде публикаций гистологическое стадирование подвергается жесткой критике из-за трудности, возникающей при его воспроизводимости. Отмечают, что процент расхождения в оценке гистологической дифференцировки иногда составляет 50-60%.

Однако когда критерии оценки гистологической степени злокачественности оценивают профессионально и тщательно, совпадение результатов этой оценки составляет 90%.

H.F. Frierson и соавторы прорецензировали патологоанатомические заключения 7 патологоанатомов, проводивших исследование 75 случаев инвазивного протокового РМЖ. Совпадение при оценке гистологической структуры составило 71%, тубулярных структур — 81%, полиморфизма ядер — 64%, митозов — 67%.

C.W. Elston рекомендует проводить двойное исслeдoвание. Это возможно при проведении исследования двумя патологами или одним патологом дважды на разных образцах.

Следующим недостатком предложенной Bloom и Richardson системы градаций РМЖ стало то, что большая часть пациентов относится к 2-й и 3-й степени градации. С .W. Elston, используя модифицированную систему гистологической градации Bloom и Richardson, исследовал рак молочной железы у 1831 пациентки с периодом наблюдения 16 лет и диагностировал 1-ю степень гистологической дифференцировки рака в 18%, 2-ю — в 34%, 3-ю — в 47% случаев.

Автором отмечена очень выраженная корреляция с клиническим прогнозом. У пациенток с раком 1-й степени злокачественности значительно лучшая выживаемость, чем со 2-й и 3-й степенью (р<0,0001). Случаи рака 2-й и 3-й степени составили 81%, однако между ними не отмечали значительной разницы в общей выживаемости, и особенно безрецидивной выживаемости.

Для решения этой проблемы Doussal с соавторами изменил схему Bloom и Richardson. Авторы провели анализ РМЖ 1262 пациенток со сроком наблюдения более 10 лет (табл. 3). В 55% наблюдений опухоль отнесли к 2-й гистологической стадии дифференцировки, что составляет довольно много.

Таблица 3. 10-летняя выживаемость больных инвазивным РМЖ (Pereira H. et al., Histopathol, 1995)
mrf_t_3.jpg

Они предложили более детально тестировать эту группу, изучая только количество митотических фигур и полиморфизм ядep. Количество фигур митоза высчитывали в 10 полях зрения на периферии опухоли, используя среднее увеличение. Затем исследовали участок с наибольшим количеством митозов в 400 полях зрения при увеличении 400 и присваивали баллы: 1 митоз (х 400) — 1 балл, 2 митоза (х 400) — 2 балла, 3 и более митозов (х 400) — 3 балла.

Используя данную методику, авторы распределили случаи РМЖ на 5 групп, которые имели статистически значимый уровень риска возникновения метастазов и рецидивов. Соответственно рак 2-й степени злокачественности по Bloom и Richardson разделили на 3 группы.

Модифицированная схема по Scraff Bloom Richardson

A. Оценка полиморфизма ядра: 1, 2, 3 балла присваивают соответственно схеме Bloom-Richardson

B. Подсчет количества митотических фигур: изучение периферии опухоли с целью выявления участков с наиболее высокой митотической активностью, затем подсчет количества митотических фигур в 400 полях зрения микроскопа с увеличением 400 (1 митоз — 1 балл, 2 — 2 балла, 3 и более — 3).

Суммирование баллов по этим двум показателям позволит определить градацию рака: G1 — 2 балла, G2 — 3 балла, G3 — 4 балла, G4 — 5 баллов, G5 — 6 баллов.

C. Распределение пациентов на две основные группы риска возникновения метастазов и рецидива: пациенты низкого риска — G1, G2, G3, пациенты высокого G4, G5.

C.W. Elsston с соавторами в своих исследованиях изучили прогностическое значение гистологических типов рака молочной железы. Результаты их исследований показали, что «особые типы РМЖ» составляют около 25% и большинство из них относят к G1.

Использование гистологического типа вместе с градациями по Bloom и Richardson помогает более точно прогнозировать поведение опухоли.

Н. Pereira и соавторы исследовали 2568 больных РМЖ и установили, что гистологическая градация, статус лимфатических узлов, размер опухоли и гистологический тип рака являются наиболее важными прогностическими признаками (табл. 5). Причем гистологический тип рака имеет самостоятельное значение.

Более поздние исследования, представленные в классификации ВОЗ (2003), подтверждают выводы Н. Pereira о самостоятельном прогностическом значении гистологических типов рака.

Учитывая, что особые гистологические типы РМЖ не всегда протекают клинически благоприятно (табл. 4), а клиницисты не всегда знают значение гистологических типов и предпочитают пользоваться разделением опухоли по степени злокачественности, многие исследователи рекомендуют проводить оценку всех гистологических типов рака молочной железы по схеме Bloom и Richardson.

Таблица 4. Показатель 10-летней выживаемости больных РМЖ в зависимости от гистологического типа опухоли (поданным Health Organization Classification of Tumors, Lyon, 2003)
mrf_t_4.jpg

Таким образом в диагнозе патологоанатома кроме гистологического типа рака должна быть указана степень гистологической дифференцировки. C.W. Elston и I.O. Ellis обобщили существующие сведения и разработали практические рекомендации для патологоанатомов (табл.5, 6).


Таблица 5. Полуколичественный метод оценки гистологической дифференцировки РМЖ (по Elston и Ellis)
mrf_t_5.jpg

Таблица 6. Подсчет фигур митоза для определения баллов
mrf_t_6.jpg

Методика определения гистологической дифференцировки рака молочной железы

В опухоли оценивается наличие тубулярных структур, ядерного полиморфизма и количество фигур митоза. Каждому из этих показателей присваивается от 1 до 3 баллов.

Для оценки общей степени дифференцировки количество баллов суммируется. Возможное количество баллов от 3 до 9, где 3-5 баллов соответствуют G1 или высокой степени, 6-7 балов — G2 или умеренной степени, 8-9 баллов — G3 или низкой степени гистологической дифференцировки.

Для определения тубулярного компонента проводят сканирование всего опухолевого среза и определяют относительный процент площади тубулярных структур. Если тубулярные структуры составляют более 75% всей площади опухоли, то рак оценивают в 1 балл, 10-75% — в 2 балла, а менее 10% — в 3 балла.

Ядерный полиморфизм оценивают следующим образом. Если ядро в клетке опухоли относительно маленькое, все клетки рака имеют однотипные ядра с одинаковым рисунком хроматина, незначительно отличающимся от ядер клеток доброкачественных протоков, опухоли присваивается 1 балл.

Опухолям, состоящим из клеток с большими ядрами, средней вариабельности и выраженным хроматином в них, присваивают 2 балла. Опухолевые клетки с очень большими ядрами неправильной, странной формы, разного размера и разным рисунком хроматина оценивают в 3 балла.

Для определения количества фигур митоза (анафазы, метафазы, телофазы) подсчет проводят в 10 полях зрения при большом увеличении по периферии опухоли, в участках наиболее высокой митотической активности.

Оценивают количество фигур митоза в баллах в соответствии с количеством клеток, находящихся в состоянии митоза на определенной площади гистологического препарата.

Например, если площадь исследуемого тканевого среза 0,274 мм2, то 0-9 фигур митоза на ней оценивают в 1 балл; 10-19 — в 2 балла; 20 и более — в 3 балла. Площадь 0,152 мм2: 0-5 фигур — 1 балл; 6-10 — 2; 11 и более — 3. Площадь 0,312 мм2: 0-11 фигур — 1 балл; 1222 — 2; 23 и более — 3 балла.

При этом необходимо учитывать только клетки с четкими митотическими фигурами, не считая клетки с пикнотически измененными ядрами или гиперхромными, что может быть обусловлено апоптозом. Точные и сопоставимые результаты патологоанатом получает только при соблюдении всех требований.

Данные более чем 70-летнего опыта использования системы гистологической градации РМЖ показали важное значение ее для оценки злокачественности опухоли.

Изучение количества митозов в опухоли

Количество опухолевых клеток, синтезирующих ДНК (фракция S-фазы), коррелирует с темпом роста опухоли и клиническим прогнозом. Фракция S-фазы может быть оценена несколькими путями.

Это рутинный подсчет на гистологических срезах клеток с измененными ядрами вследствие появления вновь синтезированных ДНК, проточная цитометрия и иммуногистохимческое определение клеток в состоянии митоза. Каждый из перечисленных методов дает важную информацию, но наиболее часто используют первый.

Подсчет митотических фигур с помощью светового микроскопа остается дешевым и эффективным методом. Опухолевая клетка делится и, пройдя митотический цикл, образует две новые клетки. Этот процесс проявляется изменением структуры клеток и появлением фигур митоза.

В S-фазе ядерная мембрана отсутствует, так как клетка прошла профазу, хромосомы конденсированы, присутствует нитевидный расширенный ядерный материал, который группируется по диаметру клетки (начало метафазы) или в виде отдельных глыб хромосомных агрегатов (телофаза). Во время митоза цитоплазма более выражена. Важно научиться отличать клеточные митозы от апоптоза.

При апоптозе ядро расширено, однако нет нитевидных структур хроматина, в центре ядра оптически пустая зона, вокруг которой сгруппирован хромосомный материал в виде крута или апоптатических ядерных сегментов, цитоплазма эозинофильная. Если есть сомнения в том, что это митоз, лучше не учитывать клетку при подсчете индекса митотической активности.

Хорошо подготовленный патолог может определить при просмотре срезов, окрашенных гематоксилинэозином, фигуры митоза и вычислить индекс митотической активности. Многие исследователи считают, что индекс митотической активности является наиболее важным прогностическим показателем рака молочной железы.

I. Jannink и соавторы утверждают, что классическая техника определения индекса митотической активности остается быстрым, простым и наиболее точным методом.

Фигуры митоза подсчитывают в большом количес тве клеток по периферии опухоли, в наиболее пролиферирующем участке, избегая зон воспаления, некрозов, кальфикации, карцином in situ и крупных сосудов. Индекс митотической активности определяют подсчетом митозов в десяти полях зрения, начиная с зон наивысшей их плотности при х 400 с диаметром поля зрения 0,45 или 0,16 мм2.

Однако возникают сложности при изучении опухоли с большим количеством стромы, выраженном полиморфизме опухолевых клеток с наличием крупных аномальных ядер и опухоли, содержащей значительное количество клеток в состоянии апоптоза. Очень сложно подсчитать фигуры митоза в опухоли с незначительной митотической активностью.

Этот метод подвергался критике в связи с тем, что подобный подсчет субъективный. Кроме того, запоздалая фиксация может привести к потере митотических фигур. Однако P.J. van Diest и соавторы показали, что жесткое соблюдение критериев подсчета индекса митотической активности приводит к высокой точности исследования.

На сегодня установлено, что иммуногистохимическое исследование экспрессии ядерного белка Ki-67 (клон MIB-1) достоверно определяет клетки, находящиеся в состоянии митоза, поэтому этот метод все чаще применяют в научной и медицинской практике для оценки пролиферативной активности опухолей различной локализации, в том числе и РМЖ. Этот метод более легко воспроизводим, более точен, поэтому и приобрел популярность (фото 91, 91а, 92).

mrf_f_91.jpg
Фото 91. Инфильтрирующий протоковый РМЖ. Отмечена умеренная митотическая активность. Экспрессия Ki67 Protein (клон IVAK-2, производство DAKO). Иммуногистохимическое окрашивание, система визуализации EnVision, хромоген DAB, х 400

mrf_f_91a.jpg
Фото 91а. Инфильтрирующий протоковый рак молочной железы. Отмечена высокая митотическая активность. Экспрессия Ki67 Protein (клон IVAK-2, производство DAKO). Иммуногистохимическое окрашивание, система визуализации EnVision, хромоген DAB, х 400

mrf_f_92.jpg
Фото 92. Слизистый РМЖ. Отмечена низкая митотическая активность. Экспрессия Ki67 Protein (клон IVAK-2, производство DAKO). Иммуногистохимическое окрашивание, система визуализации EnVision, хромоген DAB, х 400

Но и у него есть недостатки, так как иммунореактивность Ki-67 во многом зависит от целого ряда методических параметров, таких как сроки фиксации образца ткани, условия его обработки и метод демаскировки антигена.

Запоздалая фиксация уменьшает количество выявленных митозов в опухоли. Результаты исследования свидетельствуют, что задержка фиксации на 3 ч уменьшает количество митозов на 10-13%.

Серьезной проблемой является значительная гетерогенность опухоли, которая проявляется в разном количестве митозов в разных участках опухоли. D. Verhoeven и соавторы сравнили количество митозов в разных участках опухоли и отметили, что на периферии инвазивного рака клетки имеют более высокую митотическую активность, чем в центре.

Однако преимуществом иммуногистохимического метода является то, что антитела к белкам, участвующим в митотическом цикле, позволяют дифференцировать клетки в состоянии митоза и не окрашивают клетки в состоянии апоптоза.

Кроме антитела Ki-67 применяют, хотя еще не очень широко, другие маркеры клеточной пролиферации, такие как ДНК-топоизомераза IIа и различные циклины. Топоизомераза IIа — фермент, участвующий в процессе клеточного деления, функция которого заключается в сегрегации хромосом.

Данную топоизомеразу выявляют в клетках, находящихся преимущественно в S-фазе клеточного цикла. Этот белок более устойчи в к повреждающему воздействию различных фиксаторов и протео-литических ферментов.

Циклины — это семейство белков — регуляторов клеточного цикла, которые осуществляют контроль над его различными фазами. Циклины D1 и Е регулируют течение фазы G1, а циклин В контролирует прохождение клеточного цикла от фазы G2 к фазе М. Циклин А наиболее интенсивно экспрессируется в S-фазе, причем его экспрессия совпадает с пиком редупликации ДНК.

В связи с этим циклин А рассматривают в качестве наиболее приемлемого маркера для изучения пролиферации клеток в опухоли, хотя точная структура этого протеина, так же, как и кодирующего гена, пока до конца не установлена. Возрастание экспрессии циклина А четко коррелирует со злокачественной прогрессией опухолей.

Кроме перечисленных антигенов, следует упомянуть ядерный антиген пролиферирующих клеток. Изучению этого антигена посвящено большое количество работ и доказана его значимость в качестве показателя активности пролиферации клеток.

R. Bravo и соавторы идентифицировали его в 1987 г. как добавочный белок дельта-ДНК-полимеразы, участвующий в синтезе ДНК. Из существующих 4 типов антител наиболее широко используют клон РС10. Экспрессия ядерного антигена пролиферирующих клеток коррелирует с другими маркерами пролиферации, такими как мечение 5-бром 2 тезоксиуридином, Ki 67 (MIB-l), величиной фракции S-фазы, определенной с помощью проточной цитометрии.

Метод прост в исполнении и дает четкое окрашивание ядер. Однако результаты ряда исследований указывают на то, что использование ядерного антигена пролиферирующих клеток приводит к окрашиванию большего количества клеток, что не соответствует пролиферативным потенциям ткани.

Поэтому мы в своей практике для изучения индекса пролиферации используем иммуногисто-химический метод с антителом Ki 67 (МТВ-1) и считаем нот маркер наиболее оптимальным.

Л.М. Захарцева, М.В. Дятел, А.В. Григорук
Похожие статьи
показать еще
 
Категории