Раздел медицины:
Онкология

Экспрессия ABCG2, ABCC2, ABCC5 и других генов при раке молочной железы

1276 0

Экспрессия ABCG2 (BCRP, MXR, ABCP) при раке молочной железы

В 1998 г. Doyle et al. из клеточной линии рака молочной железы MCF-7 при селекции с доксорубицином в присутствии верапамила (чтобы предотвратить гиперэкспрессию Pgp) впервые клонировали ген, названный BCRP.

Вскоре этот белок был выделен R. Allikmets (1998 г.) и K. Miyake (1999 г.), в связи с чем в научных публикациях встречаются другие его названия: MXR (mitoxantrone resistance protein) и ABCP (placental ABC transporter), а согласно рекомендациям HUGO (Human Gene Nomenclature Committee) - ABCG2.

Показано, что перенос этого гена в химиочувствительные клеточные линии индуцирует резистентность к митоксантону при сохранении чувствительности к цисплатину, паклитакселу и винкаалкалоидам.

Ген ABCG2 локализован в 4-й хромосоме, составляет более 66 кб и содержит 16 экзонов и 15 интронов. Белок ABCG2 (72 кДд) состоит из 655 аминокислотных остатков и имеет один N-концевой нуклеотидсвязывающий домен (НСД) и 6 С-концевых трансмембранных сегмента, составляющих один трансмембранный домен (ТМД). Таким образом, ABCG2 считается «половинчатым» белком-транспортером, и, соответственно, для формирования функционально-активного переносчика необходима его ди- или олигомеризация. Субстратами ABCG2 среди химиопрепаратов считаются ингибиторы топоизомеразы, тирозинкиназы, антрациклины, аналоги камптотецина, антиметаболиты, но не паклитаксел и винбластин.

Работа, наиболее детально характеризующая роль BCRP при раке молочной железы (РМЖ), была выполнена I. F. Faneyte et al.. Авторы изучали сопряженность экспрессии BCRP в клетках рака молочной железы и формирования устойчивости к антрациклинам. В исследовании определен уровень мРНК, при котором возможна иммуногистохимическая диагностика.

Установлено, что базальная экспрессия BCRP в опухолевой ткани молочной железы была ниже пороговых значений, однако окружающие сосуды и нормальные протоки оказались BRCP-позитивными. Не обнаружено повышенной экспрессии BRCP в образцах опухолевой ткани после химиотерапевтического или лучевого лечения, и наоборот, наблюдалась тенденция к повышенной экспрессии BRCP в тканевых образцах, не подвергавшихся указанному воздействию.

Обнаружение BCRP в образцах опухолей в значительной степени связано с наличием данного белка в эндотелии сосудов, снижение экспрессии BRCP после лечения может быть обусловлено уменьшением сосудистой плотности в опухоли вследствие химиотерапии. Экспрессия BCRP не ассоциирована с клиническим ответом или общей выживаемостью, но была отмечена более низкая экспрессия BCRP в низкодифференцированных опухолях молочной железы.

Еще в одной публикации, посвященной данному вопросу, H. Burger et al. исследовали клиническую значимость экспрессии BCRP при РМЖ. Авторами установлено, что у пациенток с поздними стадиями заболевания при высокой экспрессии BCRP в первичной опухоли отмечались более низкая результативность химиотерапии первой линии и тенденция к снижению безрецидивной выживаемости.

Исходя из полученных данных, исследователи пришли к выводу, что экспрессия BCRP может использоваться для прогнозирования реакции опухоли на химиотерапию при поздних стадиях заболевания. На основании субстратной специфичности BCRP заметную связь между экспрессией и клиническими исходами можно было бы ожидать результата у пациенток, получавших антрациклины.

Авторами обнаружена отрицательная сопряженность между экспрессией мРНК BCRP и частотой ответов на химиотерапию, а также с безрецидивной выживаемостью. У пациенток, получивших лечение FAC/FEC режимами химиотерапии, она была сильнее, чем у обследуемых, получивших адъювантную химиотерапию CMF. Таким образом, имеются данные о возможной предикативной роли экспрессии BCRP при лечении антрациклинсодержащими режимами химиотерапии.

Изложенные выше данные показывают, что экспрессия BCRP может иметь некоторую прогностическую значимость в определении клинического исхода, в частности при лечении рака молочной железы антрациклинами. Вместе с тем роль BCRP в развитии лекарственной устойчивости заболевания требует более детального изучения.

Экспрессия ABCC2 (MRP2) при раке молочной железы

Структурно MRP2 сходен с MRP1, состоит из двух АТФ-связывающих (нуклеотидсвязывающих доменов, трех трансмембранных доменов, и экстраклеточного (экстрацитозольного) NH2 -конца. Однако MRP1 и MRP2 различаются по уровню их экспрессии в нормальных тканях, а также локализации на мембране поляризованных клеток.

Например, MRP1 экспрессируется во многих тканях организма и локализуется на базолатеральной мембране поляризованных клеток, в том числе гепатоцитах и пневмоцитах, в то время как MRP2 находится преимущественно на каналликулярной (апикальной) мембране гепатоцитов, где участвует в билиарном транспорте.

Ген множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) ABCC2 (MRP2) локализуется в 10-й хромосоме и содержит 32 экзона. Человеческий протеин MRP2 состоит из 1545 аминокислот и участвует в выделении экзогенных и эндогенных веществ, как правило, связанных с глутатионом, глюкуронидом или сульфатами.

Изменения уровней экспрессии MRP2 анализировались при различных патологических процессах. Так уровень MRP2 значительно ниже при обструктивном холестазе и хроническом воспалительном процессе. Высокие уровни экспрессии MRP2 наблюдаются при различных локализациях злокачественных новообразований: колоректальный рак, гепатомы, рак легкого, рак желудка и могут быть ассоциированы с лекарстенной резистентностью.

Изначально гиперэкспрессия MRP2 была обнаружена в цисплатин-резистентных опухолевых клетках. Более того, в экспериментах in vitro показана роль гиперэкспресии MRP2 в формировании резистентности к этопозиду, цисплатину, доксорубицину и эпирубицину. Гиперэкспрессия MRP2 коррелировала с химиорезистентностью гепатоцеллюлярного, колоректального рака к платинсодержащим режимам химиотерапии.

Также гиперэкспрессия ABCC2 была отмечена в тамоксифен-резистентных формах РМЖ. Исследование, проведенное в Японии, подтвердило, что A аллель ABCC2 68231 A.G является фактором риска возврата заболевания после пяти лет приема тамоксифена, в отличие от ABCC2 1C (-24 C.T) и ABCB1 3435 C.T. При этом в научной работе I. Sensorn et al. не выявлено влияния ни ABCC2 68231 A.G, ни ABCC2 1C (-24 C.T) на эффективность адъювантной терапии тамоксифеном.

Экспрессия ABCC2 (MRP2) при раке молочной железы определялась в ряде исследований как методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), так и иммуногистохимическим методом диагностики. В научной работе L. I. Liang-Hong экспрессия MRP2 оценивалась иммуногистохимически. При этом частота позитивного окрашивания MRP2 (46,7%, 56/120) в неоплазиях молочной железы была значительно выше, чем в прилегающей нормальной ткани (15,0%, 18/120) (p = 0,05).

Интересно, что I. F. Faneyte et al., используя иммуногистохимический метод диагностики, не смогли определить MRP1-3 в клеточных линиях РМЖ, при этом также отсутствовала корреляция между уровнем экспрессии мРНК данных генов и результатами иммуногистохимии (ИГХ). Авторы сделали вывод, что MRP1-3 экспрессируются в клеточных линиях рака молочной железы, однако уровень экспрессии слишком мал, чтобы быть определенным иммуногисто-химически.

Ассоциация MRP2 с химиочувствительностью опухоли также изучалась рядом исследователей. При этом в трех из пяти исследований не выявлено взаимосвязи между уровнем экспрессии и клинико-гистологическими характеристиками опухоли, а также безрецидивной и общей выживаемостью. В одном исследовании обнаружена зависимость между вектором изменения экспрессии гена до и после проведения неоадъювантной полихимиотерапии (НПХТ) и безметастатической выживаемостью, также в одном исследовании выявлена зависимость между уровнем экспрессии ABCC2 и коротким безрецидивным периодом у пациенток с эстроген-негативными опухолями.


Резюмируя вышесказанное, можно отметить, что несмотря на значительное число исследований, посвященных анализу роли АВСС2 в отношении чувствительности к цитостатической терапии, до сих пор имеется целый ряд противоречивых данных, требующих более углубленного изучения. В частности, это касается связи экспрессии данного белка с исходом заболевания, а также с многочисленными клинико-патогистологическими характеристиками рака молочной железы.

Экспрессия ABCC5 при раке молочной железы

ABCC5 представляет собой трансмембранный белок подсемейства С ABC-транспортеров и обладает способностью к транспортировке эндогенных циклических нуклеотидов. Физиологические функции ABCC5 на данный момент недостаточно изучены. Имеются данные, что данный протеин функционирует как помпа, обеспечивая обратный транспорт внутриклеточного циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и, в меньшей степени, циклического аденозинмонофосата (цАМФ).

При этом в ряде научных исследований сообщается, что при повышении содержания внутриклеточного цГМФ происходит снижение пролиферации клеток РМЖ и запуск апоптоза путем активации протеинкиназы G. ABCC5 (MRP5) вовлечен в развитие химиорезистенности к ряду препаратов, в том числе метотрексату, 5-фторурацилу. В исследовании S. Park et al. отмечено наличие связи между экспрессией ABCC5, ABCAI2, ABCAI, ABCCI3, ABCB6 и ABCC11 и более низким эффектом неоадъювантной химиотерапии у пациенток с раком молочной железы, получавших неоадъювантную терапию (p < 0,05).

Экспрессия ABCA12 при раке молочной железы

Изучение роли экспрессии ABCA12 в развитии химиорезистентности к цитостатической терапии у пациенток, страдающих РМЖ, проводилось, согласно имеющимся данным, в двух научных исследованиях. Как уже указывалось ранее, в исследовании S. Park et al. отмечено наличие связи между экспрессией ABCC5, ABCAI2, ABCAI, ABCCI3, ABCB6, и ABCC11 и более низким эффектом неоадъювантной химиотерапии у пациенток с раком молочной железы, получавших неоадъювантную терапию (p < 0,05).

Во втором исследовании, выполненном V. Hlavac в 2013 г., получены данные о повышенной экспрессии гена ABCA12 в образцах прилегающей к опухоли нормальной ткани молочной железы у пациенток со стабилизацией или прогрессированием после проведения НПХТ по сравнению с больными, достигшими полного или частичного ответа на НПХТ.

Данное исследование, на наш взгляд, имеет ряд ограничений: экспрессия генов оценивалась после проведения цитостатической терапии, которая могла повлиять на уровень экспрессии. Также следует отметить, что экспрессия оценивалась в нормальной ткани железы, в которой, по данным авторов, экспрессия данного гена была ниже по сравнению с опухолевой тканью.

Таким образом, несмотря на значительное число исследований, посвященных ABC-транспортерам при раке молочной железы и изучению их роли в отношении чувствительности к различным цитостатическим лекарственным средствам, до сих пор имеется целый ряд противоречивых данных, требующих более углубленного изучения. В частности, это касается связи экспрессии данных белков с исходом заболевания, взаимодействия их с многочисленными молекулярными маркерами.

Методика определения уровня нормализованной экспрессии генов семейства ABC

При анализе приведенных в научной литературе результатов исследований определения экспрессии белков-транспортеров семейства ABC имеется ряд сложностей, которые затрудняют интерпретацию данных. Вестерн- и нозерн-блоттинг, применяемые для определения экспрессии белка и мРНК соответственно, недостаточно чувствительны, поскольку не позволяют обнаружить низкие уровни экспрессии в клинических образцах.

Некоторые исследователи, применяющие полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на основе анализов при выявлении мРНК конкретных генов МЛУ, не принимали во внимание тот факт, что продукт количественный амплификации считается наиболее точным в экспоненциальной фазе реакции. Ряд работ проведен с использованием иммуногистохимического исследования фиксированных формалином тканей. При этом различия в методах фиксации могли привести к различиям в данных даже при использовании одинаковых наборов антител.

В связи с этим разработана методика определения уровня нормализованной экспрессии генов семейства ABC (ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCAI2, ABCG2) в образцах из парафинфиксированных срезов опухолевой ткани пациенток, страдающих РМЖ, позволяющая оценивать уровень экспрессии генов, кодирующих данные белки, а не продукта, и получать быстрый результат (в отличие от традиционного иммуногистохимического метода).

Из парафинфиксированных срезов опухолевой ткани молочной железы выделяют РНК человека, проводят реакцию обратной транскрипции для получения кДНК, которую используют для проведения TaqMan ПЦР в режиме реального времени с использованием подобранных пар праймеров и зондов (табл. 16).

Таблица 16. Последовательность пар праймеров и зондов для исследуемых генов семейства ABC

mrmj_t16.jpg

Для определения уровня нормализованной экспрессии генов ABCC1, ABCC2, ABCA12, ABCG2, праймеры и зонды вносят в концентрации 3,2 пмоль/мкл, затем проводят амплификацию по программе:

1 цикл: 95 °С - 15 мин; 50 циклов: 95 °С - 20 с, 60 °С - 20 с, 72 °С - 15 с; 1 цикл: 72 °С - 10 мин.

Проводят детекцию флуоресценции по каналам FAM для генов семейства ABC (ABCC1, ABCC2, ABCA12, ABCG2) и JOE для гена HGUS (рис. 27).

mrmj_27.jpg
Рис. 27. Кривые флуоресценции для определения порогового цикла амплификации специфического фрагмента генов АВСС2 (канал FAM), HGUS (канал JOE)

Для определения уровня нормализованной экспрессии гена ABCC5, праймеры и зонды вносят в концентрации 3,2 пмоль/мкл, затем проводят амплификацию по программе:

1 цикл: 95 °С - 15 мин; 50 циклов: 95 °С - 20 с, 58 °С - 20 с, 72 °С - 15 с; 1 цикл: 72 °С - 10 мин.

Проводят детекцию флуоресценции по каналам FAM для гена ABCC5 и JOE для гена HGUS.

Расчет процента уровня нормализованной экспрессии производится по формуле:

2 - (Ct интересующего гена - Ct гена HGUS) х 100%, 

где Ct - пороговый цикл (cycle threshold).

При выявлении в исследуемом материале по каналу JOE (референсный ген HGUS) значений порогового цикла (Ct) в пределах 0-17 или 36-50 циклов делают заключение об отсутствии в исследуемом материале клеток человека и вывод о невозможности оценки экспрессии генов семейства ABC в данном образце.

Таким образом, данную методику можно использовать для определения уровней нормализованной экспрессии генов ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCA12 и ABCG2 в образцах из парафинфиксированных срезов опухолевой ткани при раке молочной железы.

Ю.Е. Демидчик, С.А. Костюк, И.Ю. Третьяк
Похожие статьи
показать еще
 
Категории