Раздел медицины:
Онкология

Биологическое значение и механизмы действия глутатион-S-трансфераз при раке молочной железы

1142 0
В последние годы появляется все больше научных данных, подтверждающих роль ферментов, в частности глутатион-S-трансфераз, в определении внутривидовых различий в реакциях на противоопухолевое лечение.

Тем не менее по этому вопросу имеется ряд неоднозначных и порой противоречивых данных.

В процессе эволюции выработались определенные способы адаптации организма к действию химических веществ, включающие токсико-кинетические, структурные, иммунологические, метаболические, токсико-динамические механизмы.

Биотрансформация ксенобиотиков

Большинство ксенобиотиков при попадании в организм не оказывают прямого биологического эффекта и подвергаются биотрансформации, т. е. энзиматическому превращению жирорастворимых экзогенных или эндогенных соединений в полярные водорастворимые метаболиты, легко выводимые из организма.

При этом промежуточные продукты биотрансформации могут быть более токсичными по сравнению с исходными соединениями, обладать более выраженной канцерогенной активностью. Биотрансформация ксенобиотиков является трехступенчатым процессом, включающим три фазы: активацию, детоксикацию и элиминацию.

Фаза 1 (активации) осуществляется при участии цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ, а также семейством нецитохромных окислителей (эстеразы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы и др.). В ходе реакций окислительно-восстановительного или гидролитического превращения молекула вещества обогащается полярными функциональными группами, что делает ее реакционно-способной и водорастворимой.

Активные промежуточные электрофильные метаболиты считаются основным субстратом для ферментов фазы 2. Важная особенность системы ферментов фазы 1 заключается в их избирательной локализации и высокой активности, проявляемой на главных путях поступления ксенобиотиков в организм - пищевом (печень, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ)) и дыхательном (легкие, бронхи).

Во время этапа детоксикации происходит биохимическая инактивация реактивных метаболитов, главным образом путем образования преимущественно гидрофильных соединений. Ферменты фазы 2 представительствуют во всех клетках и функционируют при любых путях поступления ксенобиотиков: именно они осуществляют или завершают процесс детоксикации. В этом этапе принимают участие глутатионтрансферазы, глюкуронил-трансферазы, сульфотрансферазы, ацетилтрансферазы и др., превращающие продукты метаболизма фазы 1 в полярные водорастворимые соединения, подлежащие выведению из организма.

В фазе элиминации осуществляется выведение из организма продуктов детоксикации через легкие, почки, кишечник. Активная секреция ксенобиотиков или их метаболитов в мочу, желчь и кишечник осуществляется гликопротеином-Р, а также транспортерами органических анионов и катионов.

Глутатион-S-трансферазы (GST) - группа мультифункциональных димерных белков, которые действуют как ферменты или связывающие белки в ходе осуществления многих процессов биотрансформации. В настоящее время выделяют пять основных классов GST: GSTA (a), GSTM (ц), GSTP (я), GSTS (0) и GSTT (0). Деление на классы основано на степени гомологии аминокислотных последовательностей этих ферментов и их иммунореактивности.

GST осуществляют четыре основных типа реакций:

1. Присоединение к субстрату (R) полной молекулы восстановленного глутатиона (GSH): R + GSH -> HRSG.

2. Нуклеофильное замещение: RX + GSH -> HSG + НХ. Удаляемыми группами в этой реакции могут быть галоген-, NO2-, HSO-, R0-, RS-, CN- и др.

3. Восстановление органических гидроперекисей: ROOH + 2 GSH ->ROH + GSSG + H2O.

GST не расщепляют перекись водорода, но способны катализировать превращения органических гидроперекисей в соответствующие спирты, проявляя «неселеновую» глутатионпероксидазную активность. Необходимо отметить, что сродство большинства органических гидроперекисей к GST ниже, чем к глутатионпероксидазе, однако повышение эффективности работы GST достигается за счет их более высокого содержания в клетке.

Также некоторые изоформы GST, по сравнению с глутатионпероксидазой, более активны к пероксидам тимина и ДНК. В состав хроматина входят GST, которые восстанавливают окисленную ДНК и рассматриваются как ферменты репарации.

4. Изомеризация (стероидов и простагландинов). Все GST -гомо- и гетеродимеры с молекулярной массой 43-57 кДа. В каждой субъединице имеется по одному независимому активному центру, в котором различают субцентры G и Н.

Первый связывает восстановленный глутатион, в этом субцентре содержатся гистидин, аргинин и SH-группа. Субцентр Н присоединяет гидрофобный субстрат, в нем содержится глицин. Много GST содержится в тканях, особенно в печени (до 10% от всех растворимых белков), ферменты локализуются преимущественно в цитоплазме, около 4-6% суммарной активности GST в клетке приходится на долю эндоплазматического ретикулума.

Гены GST характеризуются выраженным природным полиморфизмом, обусловленным различиями в последовательности нуклеотидов. Наиболее изучен делеционный полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1, при котором соответствующие белки не образуются. Полиморфизм других генов (GSTA1, GSTP1 и др.) представлен главным образом однонуклеотидными заменами. Уровень активности фермента GST класса Т почти в 10 раз выше, чем глутатионтрансферазная активность белков А, М и Р классов.

Существуют научные данные о том, что фермент GSTT1 быстрее связывается с субстратом (ксенобиотиком) и нейтрализует активированные ксенобиотики, а также быстрее, чем другие изоформы GST, вступает в новый цикл. Ген GSTT1 картирован на хромосоме 22 (22q11.2), его основной полиморфизм обусловлен делецией, которая сопровождается формированием двух типов аллелей: функционально активного (GSTT1 1) и неактивного или нулевого (GSTT1 0).

Аллель GSTT1 0 приводит к отсутствию синтеза фермента. Степень распространенности делеции гена GSTT1 различается в разных этнических группах: В африканской популяции GSTTJ-нуль генотип встречается с частотой 15-26%, в австралийской популяции - 9-19%, у европейцев -10-21%.


Среди GST класса ц выделяют пять групп: GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4 и GSTM5, представляющих собой результат альтернативного сплайсинга гена GSTM, который локализуется в области 1q13.3. GSTM1 имеет четыре аллельных варианта: GSTM1 А, GSTM1 В, GSTM1 С и GSTM1 0. Первые два аллеля функционально не различаются, а аллель GSTM1 С встречается крайне редко.

Вариант GSTM1 0 - нулевой аллель (делеция внутри гена протяженностью около 10 тыс. п. н.) проявляется как отсутствие фермента GSTM1. Гомозиготное носительство делеции гена GSTM1 (генотип GSTM1 0/0, «нулевой» генотип) достигает 50% и более во многих этнических группах. Например, в африканской популяции частота GSTM1 0 варьируется от 23 до 48%, в азиатской - от 33 до 63% , а в европейской - от 39 до 62%. Частота нулевого аллеля GSTM1 у жителей России составляет 40-47%.

Ген GSTP1 также полиморфен, поскольку в кодирующем регионе обнаружены две мутации, которые обусловливают различия субстрат-специфичной каталитической активности. Полиморфизм в 5-м экзоне гена GSTP1 приводит к замене аминокислоты в активном участке Н-сайта, который отвечает за субстратную специфичность фермента. Два полиморфизма наиболее распространены: Ile105Val (замена изолейцина на валин в 105-м положении) и Ala114Val (замена аланина на валин в 114-м положении).

При замене аденина (А) на гуанин (G) в положении 313 гена GSTP1 в ферменте GSTP1 изолейцин (Ile) в положении 105 заменяется на валин (Val). Генотипы полиморфного варианта Ile105Val гена GSTP1 могут обозначаться Ile/Ile, Ile/Val и Val/Val или, соответственно, АА, AG и GG. Аллель GSTP1105Val достаточно распространен: он имеется почти у 50% лиц европеоидной расы, причем 10-15% составляют гомозиготы. В то же время аллель Ala114Val более редок.

Несмотря на достигнутые за последние десятилетия значительные успехи в объяснении и понимании молекулярно-клеточных механизмов действия глутатион-S-транфераз, остаются не до конца изученными вопросы о роли изоформ ферментов GST в индивидуальной чувствительности организма к воздействию факторов внешней среды.

Методика определения уровня нормализованной экспрессии генов семейства GST

Традиционным методом изучения белков семейства GST является иммуногистофимический метод (ИГХ), который является дорогостоящим и длительным в исполнении. Методика определения уровня экспрессии генов семейства GST в образцах из парафинфиксированных срезов пациенток, страдающих раком молочной железы, позволяет оценивать уровень нормализованной экспрессии генов и получать быстрый результат.

Из парафинфиксированных срезов опухолевой ткани молочной железы выделяют рибонуклеиновую кислоту (РНК) человека, проводят реакцию обратной транскрипции для получения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которую используют для проведения TaqMan полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием подобранных пар праймеров и зондов:

1. Для гена GSTM1:

• forward-праймер - AAGTTGGCATGCCCATGATACTGG;
• reverse-праймер - CGTCCCCCATCGTGTACTTCTTTTC;
• TaqMan зонд FAM - CCATCCGCCTGCTCCTGGAATA - BHQ1.

2. Для гена GSTT1:

• forward-праймер - AGAGTTGGATGTGACCCTGCA;
• reverse-праймер - TCAGCTAAGGAGATGTGAGGACC;
• TaqMan зонд FAM - TTGCTCGAGGACAAGTTCCTCCAGAA - BHQ1.

3. Для гена GSTP1:

• forward-праймер - CTGCAGATCTCCTTCGCTGA;
• reverse-праймер - ACATATGCTGAGAGCAGGGG;
• TaqMan зонд FAM - CTGCTGGACTTGCTGCTGAT - BHQ1.

4. Для контрольного референсного гена HGUS:

• forward-праймер - CTCCAAGGAATTTTGCCGATT;
• reverse-праймер - GGCGTGAAGATCCGGTTTTTA;
• TaqMan зонд JOE - TGTTCAGTCACCGACAGTGCTG - BHQ2.

При этом для определения наличия/отсутствия экспрессии гена GSTM1 праймеры и зонды вносят в концентрации 3,2 пмоль/мкл, затем проводят амплификацию по программе: 1 цикл:

95 °С - 5 мин; 50 циклов: 95 °С - 20 с, 62 °С - 20 с, 72 °С - 15 с; 1 цикл: 72 °С - 10 мин.

Проводят детекцию флуоресценции по каналам FAM для гена GSTM1 и JOE для гена HGUS. Наличие экспрессии гена GSTM1 определяется по каналу FAM при этом значения порогового цикла находится в пределах от 18 до 35, и по каналу JOE для гена HGUS значение порогового цикла находится в пределах от 18 до 35. Отсутствие экспрессии гена GSTM1 определяется по каналу FAM - значение порогового цикла не определяется или больше 35, а по каналу JOE для гена HGUS значение порогового цикла находится в пределах от 18 до 35.

Для определения уровня нормализованной экспрессии генов GSTT1, GSTP1 праймеры и зонды вносят в концентрации 3,2 пмоль/мкл, затем проводят амплификацию по программе:

1 цикл: 95 °С - 15 мин; 50 циклов: 95 °С - 20 с, 58 °С - 20 с, 72 °С - 15 с; 1 цикл: 72 °С - 10 мин.

Проводят детекцию флуоресценции по каналам FAM для генов GSTT1, GSTP1 и JOE для гена HGUS.

Расчет процента уровня нормализованной экспрессии генов GSTT1, GSTP1 проводится по формуле:

2 - (Ct интересующего гена - Ct гена HGUS) x 100%,

где Ct - пороговый цикл (cycle threshold).

При выявлении в исследуемом материале по каналу JOE (референсный ген HGUS) значений порогового цикла (Ct) в пределах 0-17 циклов или 36-50 циклов делают заключение об отсутствии в исследуемом материале клеток человека и вывод о невозможности оценки экспрессии генов семейства GST в данном образце.

Таким образом, данную методику можно использовать для определения уровней нормализованной экспрессии генов GSTT1, GSTP1 и GSTM1 в образцах из парафинфиксированных срезов опухолевой ткани при раке молочной железы.

Ю.Е. Демидчик, С.А. Костюк, И.Ю. Третьяк
Похожие статьи
показать еще
 
Категории