Раздел медицины:
Онкология

Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения ракового антигена (СА 15-3) в сыворотке и плазме крови человека

1358 0

Назначение

1.1. Набор реагентов ОнкоИФА-СА 15-3 предназначен для количественного определения концентрации ракового антигена CA 15-3 в сыворотке и плазме крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. При исследовании на СА 15-3 измеряется концентрация белкового продукта гена MUC1. Это большой трансмембранный гликозилированный белок, содержащий три основных домена: большой внеклеточный участок, внутримембранную последовательность и цитоплазматический домен.

Хотя физиологическая функция белка MUC1 до конца не выяснена, показано, что этот гликопротеин вовлечен в процессы межклеточной адгезии, иммунные реакции и образование метастазов. По сравнению со здоровой тканью молочной железы, в ткани карциномы молочной железы белок MUC1 определяется в более высокой концентрации, но отличается меньшей степенью гликозилирования.

Повышенные концентрации СА 15-3 отмечают при раке легкого, яичников, прямой кишки. Однако известно, что у 2 % здоровых женщин концентрация СА 15-3 может быть повышена. Также есть данные, что у 7 % пациентов с незлокачественными заболеваниями отмечают повышенные концентрации СА 15-3.

Поэтому с клинической точки зрения определение только концентрации СА 15-3 не имеет диагностической ценности при тестировании на наличие злокачественных новообразований. Этот результат следует использовать только в сочетании с иными клиническими проявлениями, результатами наблюдений и диагностическими параметрами.

В настоящее время наиболее важным клиническим применением определения СА 15-3 является мониторинговая терапия пациентов с распространенным раком молочной железы, который невозможно оценить иными клиническими или радиологическими методами. Для прогнозирования течения заболевания у пациентов со впервые диагностированным раком молочной железы необходимо рассматривать данные о концентрации СА 15-3 до операции в сочетании с иными прогностическими факторами.

1.3. Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 41 неизвестных, 6 калибровочных проб и одной пробы для определения оптической плотности раствора тетраметилбензидина (ТМБ) при использовании всех стрипов одновременно (всего 96 определений).

Примечание: в случае дробного применения набор может быть использован только в течение 1,5 месяцев после вскрытия компонентов набора.

Характеристика набора

2.1. Принцип действия

В наборе ОнкоИФА-СА 15-3 использован двухстадийный «сэндвич» вариант количественного иммуноферментного анализа. На первой стадии анализа в лунки, покрытые стрептавидином, вносятся калибровочные пробы с известным содержанием СА 15-3, разведенные контрольные и анализируемые образцы.

Затем добавляется раствор моноклональных антител к СА 15-3, конъюгированных с биотином, и реагенты перемешиваются. В результате реакции между моноклональными антителами и молекулой СА 15-3 образуется комплекс, который связывается со стрептавидином, иммобилизованным на стенках лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободных и связанных антителами белков сыворотки крови.

Затем в лунки добавляется раствор конъюгированного с ферментом антитела, специфичного к другому эпитопу молекулы СА 15-3. Меченное ферментом антитело связывается с молекулами СА 15-3, которые ранее были иммобилизованы во время первой инкубации. Несвязавшийся конъюгат удаляется путем промывки. Во время инкубации с ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации СА 15-3 в образце.

2.2. Состав набора

• комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованным стрептавидином, маркирован «Стрипы с иммобилизованным стрептавидином» — 1 упаковка;

• 6 калибровочных проб (КП) с известной концентрацией СА 15-3, содержащие соответственно: 0, 10, 40, 100, 200 и 400 Ед/мл. Точные значения концентраций в калибровочных пробах указаны на этикетках флаконов — 6 флаконов (1 мл);

• раствор, содержащий конъюгат моноклональных антител (IgG) к СА 15-3 с биотином, маркирован «Конъюгат Е №1» — 1 флакон (12 мл);

• раствор, содержащий конъюгат моноклональных антител (IgG) к СА 15-3 с пероксидазой хрена, маркирован «Конъюгат Е №2» — 1 флакон (12 мл);

• концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер М» — 1 флакон (20 мл);

• буфер для разведения образцов сыворотки крови, маркирован «Буфер Д» — 1 флакон (50 мл);

• раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» — 1 флакон (14 мл);

• стоп-реагент (1Н соляная кислота), маркирован «Стоп-реагент» — 1 флакон (14 мл).

Аналитические и диагностические характеристики

3.1. Специфичность. Перекрестная реакция антител к СА 15-3 с другими аналитами и интерференция приведены в таблице.

Таблица 1. Перекрестная реакция антител к СА 15-3 с другими аналитами и интерференция

onkm_tp1.jpg

3.2. Коэффициент вариации результатов определения СА 15-3 в одном и том же образце с использованием набора ОнкоИФА-СА 15-3 не превышает 8%.

3.3. Линейность. Зависимость концентрации СА 15-3 в исследуемых образцах при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне 10-400 Ед/мл и составляет 90-110%.

3.4. Чувствительность. Аналитическая чувствительность набора ОнкоИФА — СА 15-3 составляет 0,2 Ед/мл.

3.5. Хук-эффект высоких концентраций. В наборах реагентов, основанных на «сэндвич»-принципе анализа, при высоких концентрациях аналита зависимость величины оптической плотности от концентрации становится обратно пропорциональной (так называемый хук-эффект высоких концентраций). При использовании набора ОнкоИФА-СА 15-3 хук-эффект не наблюдается.

3.6. Клиническая проверка. У большинства здоровых женщин концентрация СА 15-3 < 37 Ед/мл.

3.7. Определение «интервала нормальных концентраций» зависит от многих факторов: специфичности метода, особенностей исследуемой популяции, точности метода в конкретной лаборатории. По этой причине каждой лаборатории рекомендуется использовать предоставленный изготовителем интервал нормальных концентраций только до тех пор, пока специалистами лаборатории не будет определен интервал нормальных концентраций, характерный для конкретной популяции в месте расположения лаборатории.

Меры предосторожности

4.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.

4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

4.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).

4.4. Компоненты на основе крови человека, входящие в состав набора, проверены на ВИЧ и гемоконтактные гепатиты. Однако ни один из существующих методов проверки не дает абсолютной гарантии отсутствия возбудителя, поэтому эти компоненты являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.

4.5. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

4.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

4.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

Оборудование и материалы

• Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках при длинах волн 405 нм и 450 нм.

• пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; на 40-200 мкл; на 200-1000 мкл; на 1000-5000 мкл;

• пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл;


• ванночки для конъюгата Е №1, конъюгата Е №2, ТМБ и стоп-реагента;

• цилиндр мерный, позволяющий отмерять 1000 мл;

• вода дистиллированная;

• бумага фильтровальная;

• перчатки резиновые или пластиковые.

Анализируемые образцы

В качестве исследуемого материала используется сыворотка или гепаринизированная плазма крови человека. Образцы сыворотки и плазмы крови разрешается хранить при температуре +2...8°C не более 5 суток; при необходимости более длительного хранения рекомендуется аликвотировать образец и хранить в замороженном виде при температуре ~20°C или ниже. Не допускаются повторные циклы замораживания-размораживания образца.

Подготовка реагентов к анализу

7.1. Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необходимо выдержать при комнатной температуре (+18...25°С) не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов.

7.2. Перед проведением анализа все реагенты, контрольные и исследуемые образцы должны быть доведены до комнатной температуры.

7.3. Калибровочные пробы, буфер Д, конъюгат Е №1, конъюгат Е №2, раствор ТМБ и стоп-реагент готовы к использованию.

7.4. Промывочный буфер. Необходимое количество буфера М развести дистиллированной водой в 50 раз.

Например: 5 мл буфера М+245 мл дистиллированной воды.

7.5. Исследуемые образцы. Предварительно развести исследуемые и контрольные образцы в 21 раз.

Пример подготовки образца к анализу:

25 мкл исследуемого или контрольного образца+500 мкл буфера Д.

Если концентрация СА 15-3 в предварительно разведенном образце составила более 400 Ед/мл, следует подготовить дополнительное разведение буфером Д в соотношении 1/10 или выше и проанализировать повторно.

Проведение анализа

8.1. В зависимости от количества определяемых образцов подготовить соответствующее количество реагентов, которые перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры (+18...25°С).

Таблица 2. Схема проведения анализа.

onkm_tp2.jpg

8.2. Составить протокол маркировки лунок.

Лунки промаркировать следующим образом:

А1, А2 — № 1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;

В1, В2 — № 2 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 0 Ед/мл;

С1, С2 — № 3 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 10 Ед/мл;

D1, D2 — № 4 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 40 Ед/мл;

Е1, Е2 — № 5 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 100 Ед/мл;

F1, F2 — № 6 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 200 Ед/мл;

G1, G2 — № 7 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 400 Ед/мл;

8.3. С помощью полуавтоматической пипетки внести по 25 мкл калибровочных проб и предварительно разведенных исследуемых образцов в соответствующие лунки.

8.4. Внести во все лунки, кроме А1 и А2, по 100 мкл конъюгата Е №1.

Примечание: Чрезвычайно важно вносить все реагенты как можно ближе ко дну покрытой стрептавидином лунки.

8.5. Перемешать реагенты в лунках аккуратным постукиванием рамки со стрипами в течение 20-30 секунд.

Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольных и исследуемых образцов не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным результатам.

8.6. Инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре (+18...25 °С) без шейкирования.

8.7. По окончании инкубации удалить содержимое лунок путем декантирования или аспирации. После декантирования осторожно постучать планшетом по листу фильтровальной бумаги для удаления капель жидкости. Промыть лунки три раза. При каждой промывке во все лунки добавлять по 300 мкл промывочного буфера, предварительно приготовленного к работе (см. п. 7.4).

Примечание: Допускается применять ручное или автоматическое устройство для промывания микропланшетов в соответствии с инструкцией изготовителя.

8.8. Добавить во все лунки кроме А1 и А2 по 100 мкл конъюгата Е №2. После добавления реагента микропланшет не встряхивать.

8.9. Инкубировать при комнатной температуре 60 минут без шейкирования.

8.10. Промыть лунки как указано в п.8.7.

8.11. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ. После добавления реагента микропланшет не встряхивать.

8.12. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной температуре в течение 20-30 минут в зависимости от интенсивности окрашивания.

8.13. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 50 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции и осторожно перемешать в течение 15-20 секунд.

Регистрация и учет результатов реакции

9.1. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.

В случае если оптическая плотность калибровочной пробы 400 Ед/мл превышает предел линейного измерения фотометра, необходимо переизмерить оптическую плотность в лунках при длине волны 405 нм.

Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы.

Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой (В-Вт), где Вт — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2.

В линейных координатах построить для калибровочных проб график зависимости В (ед.опт.плотн.) от концентрации СА 15-3 калибровочных пробах (Ед/мл).

Определить содержание СА 15-3 в пробах по калибровочному графику (см. Рис.1). В случае дополнительного разведения образца необходимо измеренную концентрацию СА 15-3 умножить на фактор разведения.

onkm_rp1.jpg
Рисунок 1. Типичный калибровочный график. (Запрещается использовать для оценки реальных экспериментальных данных!)

9.2. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п. 8.13, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна не более 30 минут при температуре +2...8°С.

Условия хранения и эксплуатации набора

10.1. Набор ОнкоИФА-СА 15-3 должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2...8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25 °С не более 5 суток.

Срок годности набора — 12 месяцев.

В случае дробного использования компоненты набора возможно хранить в течение 1,5 месяцев следующим образом:

• стрипы поместить обратно в пакет из алюминиевой фольги, плотно закрыть и хранить при температуре +2...8 °С.

• калибровочные пробы, конъюгат Е №1, конъюгат Е №2, раствор ТМБ и буфер Д хранить при температуре +2...8 °С.

• буфер М и стоп-реагент хранить при температуре +2...25 °С.

• промывочный буфер, подготовленный к использованию, хранить при комнатной температуре +18...25 °С не более 60 дней.

10.2. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика. Рекомендуется определение концентрации СА 15-3 в контрольных материалах.

10.3. Для проведения анализа не следует использовать гемолизированную, мутную сыворотку/плазму крови.

10.4. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

10.5. Не допускается смешивание или одновременное использование реагентов из разных партий, за исключением ТМБ и стоп-реагента.

10.6. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.

Е.О. Комлева
Похожие статьи
показать еще
 
Категории