Раздел медицины:
Онкология

Молекулярные маркеры в онкологии

1412 0
Биология XX века расшифровала молекулярные основы жизни.

Со всей очевидностью продемонстрировано, что любой живой организм состоит из многообразных раздельных форм.

Дискретность была признана фундаментальной характеристикой материального мира. Биологическая дискретность опирается на физическую и генетическую прерывности и включает их в «элементарные» структуры — электроны, атомы, молекулы, а также гены и хромосомы.

Тем самым удалось существенно приблизиться к практическому решению ряда принципиальных вопросов, которые связаны с диагностикой и лечением онкологических заболеваний.

Показательно, что ранее присуждения Нобелевской премии Кери Мюллису за открытие в 1983 году полимеразной цепной реакции (ПЦР), ученый был награжден премией Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины. Действительно, как убеждают теоретические расчеты, использование метода ПЦР позволяет обнаружить наличие у пациента опухолевого очага размером от 0,01 мм3.

Применение молекулярно-биологических технологий диагностики в практической онкологии подчинено решению следующих вопросов:

• диагностика наследственных форм рака;
• определение молекулярных маркеров ранних (доклинических) стадий развития опухоли;
• диагностика молекулярных маркеров неблагоприятной динамики заболевания;
• поиск опухолевых маркеров рецидива опухоли, а также выявление микрометастазов;
• определение полиморфных молекулярных маркеров, ассоциирующихся с повышенным риском развития того или иного типа опухоли. Фундаментальные исследования молекулярных основ канцерогенеза выявили ключевую роль в нем повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Определены и наиболее значимые в данном случае эффекты:

• хромосомные перестройки и мутации генов;
• онкогенное влияние ряда вирусов, способных взаимодействовать с геном клеток и встраиваться в молекулу ДНК.

Можно считать доказанным, что делеции определенных участков хромосом обуславливают заболевания различными типами рака (Табл.1).

Таблица 1. Хромосомные мутации при основных злокачественных новообразованиях.

onkm_t1.jpg

Не менее ясно, что мутации таких генов, как BRCA1, BRCA2, TP53, CHEK2, ATM, PIK3CA, ING4 вовлечены в процесс канцерогенеза при раке молочной железы; HRAS1, CDKN2A, p14ARF/p15 — при раке мочевого пузыря; RNASEL, ELAC2, MSR1, RTEN, KLF6, FEZ1 — при раке предстательной железы; VHL, TP53, CDKN2A — при раке почки.

К настоящему времени изучено большое количество онкогенов или доминантных раковых генов, активация которых вызывает злокачественную трансформацию клетки. Таким образом, в организме инициируется процесс формирования ее опухолевого клона.

Пристальное внимание уделяют классу антионкогенов или генам-супрессорам, продукты, которых угнетают митотическую активность клеток.

Наиболее мощным и универсальным в данном случае является ген p53, который в геноме человека размещен на коротком плече хромосомы 17 (локус 17p13.1). Соответствующий ген кодирует биосинтез ядерного фосфопротеида, включающего 393 аминокислотных остатков. Указанное соединение выполняет регуляторную роль в цикле клеточного деления. Продукт гена p53 также отвечает за процесс апоптического самоустранения клеток, которые получили критические повреждения ДНК.

Дезорганизация нормального функционирования гена p53 сопряжена с утратой контроля над клеточным циклом. В результате этого клетки, несмотря на имеющиеся повреждения молекулы ДНК, продолжают активно пролиферировать, что приводит к развитию опухоли.

Установлено наличие тесной взаимосвязи между инактивацией гена p53 и возникновением свыше 50 видов различных злокачественных новообразований (рак легкого, молочной железы, шейки матки, яичников и др.).

Ген RB1, который также входит в класс генов-супрессоров опухолевого роста, оказался первым геном, на примере которого Кнудсон еще в 1971 году сформулировал двухударную теорию канцерогенеза.

Согласно ее основному положению, переход нормальной клетки в малигнизированную предопределяет два последовательных мутационных события («удара»).

Первое из них — мутация, приводящая к образованию клетки, для которой повышен риск злокачественной трансформации. Подробные мутации могут возникать как в соматических, так и в половых (герминальных) клетках. При обнаружении носительства герминальной мутации в гене RB1 у плода, риск развития ретинобластомы составляет 90%.

Структурные изменения, затрагивающие ген RB1, и/или потеря гетерозиготности в области 13q14 были обнаружены в таких опухолях, как мелкоклеточный рак легкого (15%), опухоли яичников, молочной железы (25%), что подчеркивает роль RB1 в регуляции нормального функционирования различных тканей.

Наличие тесной взаимосвязи отдельных генов в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клетки, позволяет считать вероятным их комплексное повреждение при канцерогенезе.

В связи с этим неизменно актуальные поиски причинно-следственной связи инактивации соответствующих генов с процессом опухолевой трансформации.

Изучение механизмов возникновения и прогрессирования опухоли позволило охарактеризовать значение не только структурных изменений генов, но и эпигенетических (функциональных) факторов их регуляции (изменения, не влияющие на нуклеотидную последовательность ДНК, но сопряженные с нарушением экспрессии гена).

В результате дисбаланса метилирования наступает блокировка синтеза белковых продуктов, которые необходимы для физиологической регуляции клеточного цикла, процессов дифференцировки и апоптоза. Все это приводит к опухолевой трансформации клетки.


Аномальное метилирование как механизм, приводящий к инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, впервые был описан для гена RB1 (Sakai et al., 1991).

Для ДНК-диагностики сейчас используют разнообразные методы скрининга мутаций. Наиболее доступна идентификация мутаций, изменяющих длину амплифицированных фрагментов, которые затем выявляют при электрофоретическом анализе.

Протяженные делеции могут быть выявлены с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или с использованием дозового блотгибридизационного анализа.

С целью поиска точковых мутаций, небольших делеций и инсерций в исследуемых генах используют множество различных подходов, основанных на методе полимеразной цепной реакции. Продукты амплификации являются объектами дальнейшего поиска мутаций с помощью ряда методов, позволяющих выявлять различные структурные изменения.

Метод метилчувствительной полимеразной цепной реакции

Для определения метилирования уже известных последовательностей ДНК применяют метод метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР).

Метилспецифическая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) — метод, позволяющий оценивать состояние метилирования индивидуальных CpG-островков независимо от расположения сайтов узнавания метилчувствительных рестриктаз и особенностей метилирования аллей различного родительского происхождения.

Необходимым условием проведения исследований в области функциональной геномики и протеомики является наличие технологий и специализированного оборудования для высокопроизводительного анализа многокомпонентных биологических микрочипов (биочипов). Разработка биочиповой технологии стала возможной благодаря достижениям в области промышленного производства миниатюрных устройств, несущих многие десятки тысяч функциональных элементов на поверхностях ограниченной площади.

ДНК-биочипы

Идея использовать для гибридизационного анализа ДНК плоские стеклянные слайды-пластины (ДНК-биочипы) с иммобилизованными на них синтетическими олигонуклеотидами возникла в конце 1980-х — начале 1990-х годов в связи с необходимостью проведения структурного анализа протяженных фрагментов геномной ДНК.

Биочип, как правило, представляет собой слайд-пластинку площадью от 0,1 до 10 см3 с фиксированными на поверхности в виде индивидуальных микроточек (диаметр от 10 до 500 мкм) образцами биологически активных веществ.

Современные технологии микропечати позволяют наносить на биочип десятки тысяч индивидуальных образцов нуклеиновых кислот, белков, пептидов, полисахаридов, культур клеток, микроорганизмов и т.д. При этом необходимые количества индивидуальных препаратов составляют подчас лишь триллионные и миллиардные доли грамма (пико- и нанограммы).

Практически любые органические субстанции после несложной предварительной обработки могут быть подвергнуты анализу с помощью биочипа. Для этого экстрагированные из препаратов и химически модифицированные нуклеиновые кислоты (ДНК и рибонуклеиновая кислота (РНК)) или белки должны быть перенесены на поверхность микрочипа, с тем, чтобы осуществить регистрацию процессов межмолекулярных взаимодействий на поверхности биочипа за счет использования флуоресцентных, хемилюминесцентных или масс-спектрометрических методов.

С известной условностью можно выделить три основных типа ДНК-биочипов используемых в качестве диагностического инструмента:

• биочипы для сравнительного гибридизационного генетического анализа;
• биочипы для исследования уровней экспрессии генов;
• биочип для выявления мутаций и участков (сайтов) полиморфизма.

В настоящее время накоплен огромный объем информации, характеризующие профили экспрессии генов в клетках нормальных тканей, опухолевых клеточных линиях и трансформированных клетках из опухолевых тканей. Полученные данные включают в специализированные базы данных, которые содержат программные средства, помогающие правильно интерпретировать результаты сравнительных анализов профилей экспрессии в контексте известных биохимических схем.

Если принимать во внимание только максимально перспективные исследования, уже сейчас не трудно выделить шесть научно-прикладных направлений молекулярной диагностики в онкологии:

• идентификация маркеров, которые характерны для пусковых стадий опухолевого роста;
• обнаружение генетических нарушений, сигнализирующих о реальности неблагоприятного прогноза развития заболевания и высокой инвазивности опухоли (выраженность ее метастатического потенциала, невосприимчивость к рационально назначаемой терапии, короткая продолжительность достигаемых периодов ремиссии, значительное ухудшение качества жизни пациента);
• диагностика наличия микрометастазов;
• тестирование наследственных форм опухоли;
• поиск маркеров (полиморфных форм ДНК), определяющих эффективность химиотерапии и назначения таргетных препаратов (таргетная терапия основана на коррекции молекулярных дефектов, которые возникают в геноме клетки при опухолевой трансформации);
• анализ ДНК-полиморфизмов, повышающих риск развития конкретного типа опухоли в группах риска.

Необходимым итогом молекулярно-генетических исследований онкологии должно стать создание комплексной диагностической системы, которая будет эффективно интегрировать новейшие достижения молекулярной генетики, фундаментальной и прикладной биохимии, а также клинической онкологии.

Е.О. Комлева
Похожие статьи
показать еще
 
Категории