Раздел медицины:
Онкология

Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения хорионического гонадотропина в сыворотке крови человека

1038 0

Назначение

1.1. Набор реагентов ГонадотропинИФА-ХГч-1 предназначен для количественного определения концентрации хорионического гонадотропина в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуно-ферментного анализа.

1.2. Хорионический гонадотропин (ХГ) является гликопротеином с молекулярной массой около 37 000 Да, состоящим из двух субъединиц — альфа и бета.

Количественное определение уровня ХГ считается наиболее надежным индикатором при ранней диагностике беременности.

Изменение концентрации хорионического гонадотропина в сыворотке крови беременных женщин является важным показателем пренатальной диагностики некоторых врожденных заболеваний (открытые пороки медуллярной трубы, синдром Дауна). Кроме того, определение концентрации ХГ в сыворотке крови широко применяется в акушерстве при диагностике множественной беременности, угрозе выкидыша и внематочной беременности.

Хотя присутствие ХГ в сыворотке крови обычно связано с нормальной беременностью, повышенные уровни хорионического гонадотропина также обнаруживаются у больных с тератогенными карциномами и трофобластическими новообразованиями и (иногда в случаях эктопического синтеза хорионического гонадотропина) при раке яичка, молочной железы, тонкого кишечника, легких и предстательной железы. Уровень хорионического гонадотропина при некоторых видах рака может достигать величин, превышающих 100 000 МЕ/л. Измерение уровня хорионического гонадотропина является важным методом диагностики и мониторинга таких заболеваний.

1.3. Набор ГонадотропинИФА-ХГч-1 рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора тетраметилбензидина (ТМБ) при использовании всех стрипов одновременно (всего 96 определений).

Примечание: в случае дробного применения набор может быть использован только в течение месяца после вскрытия компонентов набора.

Принцип работы набора

В наборе Гонадотропин ИФА-ХГч-1 использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к в-субъединице ХГ. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена.

В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ХГ-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация хорионического гонадотропина, содержащегося в исследуемом образце, и связывание с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-ХГ-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованнным в ходе инкубации хорионического гонадотропина. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству хорионического гонадотропина в исследуемом образце.

Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации хорионического гонадотропина в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация хорионического гонадотропина в определяемых образцах.

Состав набора:

Состав набора:

• Комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к ХГ, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к ХГ» — 1 пакет;
• калибровочные пробы на основе сыворотки крови, аттестованные по Третьему международному стандарту хорионического гонадотропина человека WHO 75/537, содержащие известные количества хорионического гонадотропина — 0; 15; 50; 125; 250 и 500 МЕ/л; концентрации хорионического гонадотропина в калибровочных пробах могут несколько отличаться от указанных величин, точные величины указаны на этикетках флаконов — 6 флаконов (лиофилизованные препараты или жидкости по 0,5 мл);
• конъюгат анти-ХГ-пероксидаза, маркирован «Конъюгат Е» — 1 флакон (18 мл);
• концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 1 флакон (14 мл);

• раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» — 1 флакон (14 мл);
• стоп-реагент (1 Н соляная кислота), маркирован «Стоп-реагент» — 1 флакон (14 мл).
• буфер для разведения образцов сыворотки крови, маркирован «Буфер Д» — 1 флакон (20 мл);
• контрольная сыворотка с известным содержанием хорионического гонадотропина маркирована «Контрольная сыворотка» — 1 флакон (лиофилизованный препарат или жидкость 0,5 мл);
• пакет полиэтиленовый закрывающийся закрывающийся (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена).

Аналитические характеристики набора

4.1. Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции обоих моноклональных антител к р — субъединице хорионического гонадотропина с тиреотропным, лютеинизирующим и фолликулостимулирующим гормонами человека.

4.2. Коэффициент вариации результатов определения хорионического гонадотропина в одном и том же образце с использованием набора ГонадотропинИФА-ХГч-1 не превышает 8%.

4.3. Линейность. Зависимость концентрации ХГ в образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне концентраций 15-500 МЕ/л и составляет 90-110%.

4.4. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» ХГ — соответствие измеренной концентрации хорионического гонадотропина предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы 50 МЕ/л. Процент открытия составляет 90-110%.

4.5. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация хорионического гонадотропина в сыворотке крови человека не превышает 5 МЕ/л.

4.6. Хук-эффект высоких концентраций. В наборах реагентов, основанных на «сэндвич»-принципе анализа, при высоких концентрациях аналита зависимость величины оптической плотности от концентрации становится обратно пропорциональной (так называемый хук-эффект высоких концентраций). При использовании набора Гонадотропин ИФА-ХГч-1 хук-эффект не обнаружен вплоть до концентрации хорионического гонадотропина 400 000 МЕ/л.

4.7. Клиническая проверка. Концентрация хорионического гонадотропина у 200 здоровых доноров обоих полов в возрасте 18-40 лет не превышала 10 МЕ/л. В таблице приведены значения ожидаемых показателей хорионического гонадотропина у женщин на различных сроках нормально протекающей беременности и соответствующие им рекомендуемые разведения анализируемой сыворотки крови перед проведением анализа.

Таблица 1. Значения ожидаемых показателей хорионического гонадотропина у женщин на различных сроках нормально протекающей беременности и соответствующие им рекомендуемые разведения анализируемой сыворотки крови перед проведением анализа

onkm_tp6_1.jpg

4.8. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения концентраций хорионического гонадотропина, соответствующие нормальным.

Меры предосторожности

5.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.

5.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

5.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).

5.4. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. в состав набора входят образцы и производные крови человека, которые являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

5.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

5.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором

Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором:

• Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;
• прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание c амплитудой колебаний 3-4 мм и частотой 8-13 Гц (500-800 об/мин) при температуре +37°С;
• пипетки полуавтоматические одноканальные с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл; 1000-5000 мкл с наконечниками;

• пипетка полуавтоматическая восьмиканальная, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл, с наконечниками;

• цилиндр мерный, позволяющий отмерять 300 мл;
• стакан стеклянный вместимостью 500 мл;
• вода дистиллированная;
• бумага фильтровальная;
• перчатки резиновые или пластиковые.

Подготовка реагентов для анализа

7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка:

• Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.
• Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к крышкам.

Открыть флаконы и положить крышки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5 мл дистиллированной воды и закрыть крышками. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18...25°С) без перемешивания. Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая пенообразования. В течение следующих 10 минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая.

Хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца.

7.2. Буфер Д готов к использованию.

7.3. Предварительное разведение исследуемых образцов сывороток крови. Если значения ХГ в исследуемых образцах по предварительным данным выше 500 МЕ/л, образцы следует развести буфером Д в 20, 400 и 2000 раз.

Пример подготовки образца к анализу:

• Образец №1 (разведение в 20 раз): 190 мкл буфера Д + 10 мкл исследуемого образца.
• Образец №2 (разведение в 400 раз): 190 мкл буфера Д + 10 мкл образца №1.
• Образец №3 (разведение в 2000 раз): 160 мкл буфера Д+ 40 мкл образца №2.

При каждом разведении необходимо тщательное перемешивание.

7.4. Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необходимо выдержать при комнатной температуре в течение времени не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в прозрачный пакет с замком и герметично закрыть. Хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.5. Промывочный буфер. Необходимое количество буфера Р развести дистиллированной водой в 20 раз. Например: 5 мл буфера Р + 95 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре (+18...25°С) не более 5 суток. Оставшийся неиспользованным буфер Р хранить закрытым при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.6. Конъюгат анти-ХГ-пероксидаза готов к использованию.

7.7. Раствор тетраметилбензидина готов к использованию.

7.8. Стоп-реагент готов к использованию.

Проведение анализа

8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры. 

Таблица 2. Cхема проведения анализа.

onkm_tp6_2.jpg

8.2. Составить протокол маркировки лунок.

Лунки промаркировать следующим образом:

А1, А2 — №1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;

B1, B2 — №2 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 0 МЕ/л;

C1, C2 — №3 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 15 МЕ/л;

D1, D2 — №4 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 50 МЕ/л;

E1, E2 — №5 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 125 МЕ/л;

F1, F2 — №6 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 250 МЕ/л;

G1, G2 — №7 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 500 МЕ/л;

H1, H2 — №8 для измерения величины оптической плотности контрольной сыворотки.

8.3. Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 150 мкл раствора конъюгата анти-ХГ-пероксидаза.

8.4. Внести в соответствующие лунки по 50 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 50 мкл исследуемой сыворотки крови в дубликатах.

Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и образцов сывороток крови не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным результатам.

8.5. Инкубировать стрипы в течение 1 часа при встряхивании в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500-800 об/мин.

8.6. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.5, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5-10 секунд с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устройства.

8.7. Во все лунки немедленно внести по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной температуре (+18...25°С) в течение 15-30 минут в зависимости от степени развития окраски.

8.8. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1-2 минут.

8.9. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм.

Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы.

Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В — ВТ, где ВТ — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2.

В линейных координатах построить для калибровочных проб график зависимости В (ед. опт. плотн.) от концентрации хорионического гонадотропина в калибровочных пробах (МЕ/л).

Определить содержание хорионического гонадотропина в пробах по калибровочному графику. В случае предварительного разведения образцов необходимо измеренную концентрацию хорионического гонадотропина умножить на фактор разведения.

8.10. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п. 8.8, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение времени не более 20 минут при комнатной температуре (+18...25°С).

Условия хранения и эксплуатации набора

9.1. Набор ГонадотропинИФА-ХГч-1 должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2...8°C в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5 суток.

Срок годности набора — 12 месяцев.

В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом:

• стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в прозрачный пластиковый пакет с замком и герметично закрыть. Хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности;
• восстановленные (растворенные) из лиофилизованных препаратов калибровочные пробы и контрольную сыворотку хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;
• жидкие, готовые к использованию, калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;

• конъюгат Е, буфер Д и раствор ТМБ после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;
• буферный раствор для промывки лунок, подготовленный к использованию, хранить закрытым при комнатной температуре (+18.. .25°С) не более 5 суток;
• буфер Р и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

9.2. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизованную, мутную сыворотку крови, а также сыворотку, содержащую азид натрия.

9.3. Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре +2...8°С не более 2 дней; при необходимости более длительного хранения (до 3 месяцев) — при температуре -20°С и ниже. Избегать повторных циклов замораживания-размораживания.

9.4. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду следующее:

• количество независимых экспериментов, которое можно провести с помощью данного набора (4 эксперимента), ограничено объемом калибровочных проб;
• для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика и рекомендуется определение концентрации ХГ в контрольной сыворотке.

9.5. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

9.6. Не допускается смешивание или одновременное использование реагентов из разных партий, за исключением ТМБ, стоп-реагента и промывочного буфера.

9.7. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.

Е.О. Комлева
Похожие статьи
показать еще
 
Категории