Раздел медицины:
Онкология

Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения альфа-фетопротеина в сыворотке крови человека

830 0

Назначение

1.1. Набор реагентов ИФА-АФП-1 предназначен для количественного определения концентрации альфа-фетопротеина в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Альфа-фетопротеин (АФП) является гликопротеином с молекулярной массой около 70 000 Да. В процессе развития человека АФП образуется главным образом в желточном мешке и эмбриональной печени и в меньшей степени в желудочно-кишечном тракте. Своей максимальной концентрации (до 240 000 МЕ/мл) в сыворотке крови плода альфа-фетопротеина достигает в период 12-15 недель внутриутробного развития, после чего его уровень снижается и достигает нормы (0-16 МЕ/мл) к концу второго года жизни. В таких пределах в норме этот показатель сохраняется на протяжении всей жизни.

АФП, являясь главным белком сыворотки крови раннего плода, выделяется почками плода в амниотическую жидкость и оттуда через плаценту и пупочный канатик проникает в систему кровообращения матери. Уровень альфа-фетопротеина в крови беременных женщин постоянно возрастает и достигает максимума (до 400 МЕ/мл) к середине третьего триместра беременности.

Изменение концентрации АФП в сыворотке крови беременных женщин является важным показателем пренатальной диагностики некоторых врожденных заболеваний (открытые пороки медуллярной трубы, синдром Дауна). Кроме того, этот метод широко применяется в акушерстве при диагностике множественной беременности, внутриутробной смерти плода и угрозе выкидыша.

Определение уровня альфа-фетопротеина также может быть использовано при диагностике и мониторинге различных видов рака. Так, например, высокий и удерживающийся уровень АФП (800-80 000 МЕ/мл и выше) очень часто сопутствует первичной гепатоме, тератомам семенников и опухолям эндодермального синуса яичников.

1.3. Набор ИФА-АФП-1 рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ при использовании всех стрипов одновременно.

Примечание: в случае дробного применения набор может быть использован только в течение месяца после вскрытия компонентов набора.

Принцип работы набора

В наборе ИФА-АФП-1 использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к альфа-фетопротеину. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена.

В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-АФП-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация АФП, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-АФП-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации альфа-фетопротеина. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству альфа-фетопротеина в исследуемом образце.

Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного антителами конъюгата анти-АФП-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация альфа-фетопротеина в определяемых образцах.

Состав набора

Состав набора:

• комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к АФП, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к АФП» — 1 пакет;
• калибровочные пробы на основе сыворотки крови, аттестованные по Первому международному стандарту WHO на альфа-фетопротеин 72/225, содержащие известные количества АФП: 0; 10; 50; 100; 200 и 300 МЕ/мл; концентрации АФП в калибровочных пробах могут несколько отличаться от указанных величин, точные величины указаны на этикетках флаконов — 6 флаконов (лиофилизованные препараты или жидкости по 0,5 мл);
• конъюгат анти-АФП-пероксидаза, маркирован «Конъюгат Е» — 1 флакон (14 мл);
• буфер для разведения образцов сыворотки крови, маркирован «Буфер Д» — 1 флакон (10 мл);

• концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 1 флакон (14 мл);
• раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» — 1 флакон (14 мл);
• стоп-реагент (1 Н соляная кислота), маркирован «Стоп-реагент» — 1 флакон (14 мл);
• контрольная сыворотка с известным содержанием альфа-фетопротеина, маркирована «Контрольная сыворотка» — 1 флакон (лиофилизованный препарат или жидкость 0,5 мл);
• пакет полиэтиленовый закрывающийся (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена).

Аналитические характеристики набора

4.1. Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции обоих моноклональных антител к АФП с сывороточным альбумином, хорионическим гонадотропином, плацентарным лактогеном и иммуноглобулинами человека.

4.2. Коэффициент вариации результатов определения АФП в одном и том же образце с использованием набора ИФА-АФП-1 не превышает 8%.

4.3. Линейность. Зависимость концентрации альфа-фетопротеина в образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне концентраций 10-300 МЕ/мл и составляет 90-110%.

4.4. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» АФП — соответствие измеренной концентрации альфа-фетопротеина предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы 50 МЕ/мл. Процент открытия составляет 90-110%.

4.5. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация АФП в сыворотке крови человека не превышает 0,9 МЕ/мл.

4.6. В наборе ИФА-АФП-1 значения концентраций калибровочных проб выражены в МЕ/мл. Для пересчета концентраций АФП в нг/мл необходимо пользоваться соотношением: 1 нг/мл = 1,25 МЕ/мл.

4.7. Хук-эффект высоких концентраций. В наборах реагентов, основанных на «сэндвич»-принципе анализа, при высоких концентрациях аналита зависимость величины оптической плотности от концентрации становится обратно пропорциональной (так называемый хук-эффект высоких концентраций). При использовании набора ИФА-АФП-1 хук-эффект не обнаружен вплоть до концентрации альфа-фетопротеина 12 500 МЕ/мл.

4.8. Клиническая проверка. Концентрация АФП в сыворотке крови у 200 здоровых доноров обоих полов составила 0-14,4 МЕ/мл.

4.9. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения концентраций АФП, соответствующие нормальным.

Меры предосторожности

5.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.

5.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

5.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).

5.4. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. в состав набора входят образцы и производные крови человека, которые являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

5.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

5.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором

Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором:

• Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;
• прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание c амплитудой колебаний 3-4 мм и частотой 8-13 Гц (500-800 об/мин) при температуре +37°С;
• пипетки полуавтоматические одноканальные с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл; 1000-5000 мкл с наконечниками;

• пипетка полуавтоматическая восьмиканальная, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл, с наконечниками;
• цилиндр мерный, позволяющий отмерять 300 мл;
• стакан стеклянный вместимостью 500 мл;
• вода дистиллированная;
• бумага фильтровальная;
• перчатки резиновые или пластиковые.

Подготовка реагентов для анализа

7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка:


• Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.
• Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к крышкам.

Открыть флаконы и положить крышки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5 мл дистиллированной воды и закрыть крышками. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18...25°С) без перемешивания.

Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая пе-нообразования. В течение следующих 10 минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая. Хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца.

7.2. Буфер Д готов к использованию.

7.3. Предварительное разведение исследуемых образцов сывороток крови. Если концентрация АФП в исследуемых образцах по предварительным данным выше 300 МЕ/мл, образцы следует развести буфером Д в 100 и 5000 раз.

Пример подготовки образца к анализу:

• Образец № 1 (разведение в 100 раз): 990 мкл буфера Д + 10 мкл исследуемого образца.
• Образец № 2 (разведение в 5000 раз): 490 мкл буфера Д + 10 мкл образца № 1.

При каждом разведении необходимо тщательное перемешивание.

7.4. Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необходимо выдержать при комнатной температуре (+18...25°С) в течение времени не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в прозрачный пакет с замком и герметично закрыть. Хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.5. Промывочный буфер. Необходимое количество буфера Р развести дистиллированной водой в 20 раз.

Например: 5 мл буфера Р + 95 мл дистиллированной воды.

Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре не более 5 суток. Оставшийся неиспользованным буфер Р хранить закрытым при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.6. Конъюгат анти-АФП-пероксидаза готов к использованию.

7.7. Раствор тетраметилбензидина (ТМБ) готов к использованию.

7.8. Стоп-реагент готов к использованию.

Проведение анализа

8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры (+18...25°С).

Таблица 1. Схема проведения анализа.

onkm_tp5_1.jpg

8.2. Составить протокол маркировки лунок.

Лунки промаркировать следующим образом:

А1, А2 — № 1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;

В1, В2 — № 2 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 0 МЕ/мл;

С1, С2 — № 3 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 10 МЕ/мл;

D1, D2 — № 4 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 50 МЕ/мл;

Е1, Е2 — № 5 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 100 МЕ/мл;

F1, F2 — № 6 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 200 МЕ/мл;

G1, G2 — № 7 для измерения величины оптической плотности калибровочной пробы 300 МЕ/мл;

H1, H2 — № 8 для измерения величины оптической плотности контрольной сыворотки.

8.3. Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 100 мкл раствора конъюгата анти-АФП-пероксидаза.

8.4. Внести в соответствующие лунки по 20 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 20 мкл исследуемой сыворотки крови в дубликатах.

Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным результатам.

8.5. Инкубировать стрипы в течение 1 часа при встряхивании в термостатируемом шейкере при температуре  +37°С со скоростью 500-800 об/мин.

8.6. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавлять по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.5, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5-10 секунд с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устройства.

8.7. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной температуре (+18...25°С) в течение 15-30 минут в зависимости от степени развития окраски.

8.8. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1-2 минут.

8.9. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм.

Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы.

Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В — ВТ, где ВТ — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2.

В линейных координатах построить для калибровочных проб график зависимости В (ед.опт.плотн.) от концентрации альфа-фетопротеина в калибровочных пробах (МЕ/мл).

Определить содержание АФП в пробах по калибровочному графику. В случае предварительного разведения образцов необходимо измеренную концентрацию альфа-фетопротеина умножить на фактор разведения.

8.10. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п. 8.8, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение времени не более 20 минут при комнатной температуре (+18...25°С).

Условия хранения и эксплуатации набора

9.1. Набор ИФА-АФП-1 должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2...8°С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5 суток.

Срок годности набора — 12 месяцев.

В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом:

• стрипы поместить в пакет с этикеткой (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить в прозрачный пластиковый пакет с замком и герметично закрыть. Хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2...8°C в течение всего срока годности;
• восстановленные (растворенные) из лиофилизованных препаратов калибровочные пробы и контрольную сыворотку хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;
• жидкие, готовые к использованию, калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;

• конъюгат Е, буфер Д и раствор ТМБ после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°C не более 1 месяца;
• буферный раствор для промывки лунок, подготовленный к использованию, хранить закрытым при комнатной температуре (+18...25°C) не более 5 суток;
• буфер Р и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°C в течение всего срока годности.

9.2. Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре +2...8°С не более 2 дней; при необходимости более длительного хранения (до 3 месяцев) — при температуре -20°С и ниже. Избегать повторных циклов замораживания-размораживания.

9.3. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизированную и мутную сыворотку, а также сыворотку, содержащую азид натрия.

9.4. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика и рекомендуется определение концентрации альфа-фетопротеина в контрольной сыворотке.

9.5. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

9.6. Не допускается смешивание или одновременное использование реагентов из разных партий, за исключением ТМБ, стоп-реагента и промывочного буфера.

9.7. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.

Е.О. Комлева
Похожие статьи
показать еще
 
Категории