Раздел медицины:

Онкология

Васкулогенная мимикрия клеток меланомы кожи

28 Апреля в 9:16 614 0
Интересной особенностью клеток меланомы кожи является их способность к васкулогенной мимикрии.

Этот феномен представляет собой уникальную способность высокоагрессивных опухолевых клеток формировать васкулярные каналы, окруженные базальной мембраной, в отсутствии эндотелиальных клеток.

В основе определения «васкулогенная мимикрия» лежит термин «васкулогенез», который используется для обозначения формирования сосудов, окруженных эндотелиальными клетками de novo, в процессе эмбриогенеза.

Впервые васкулогенная мимикрия (ВМ) была обнаружена в гистологическом материале больных меланомой глаза и впоследствии подтверждена in vitro при культивировании опухолевых клеток на внеклеточных матриксах Матригеле или коллагене. Матригель - природный матрикс базальных мембран, экстрагированный из саркомы Энгельбрета-Холма-Суорма мыши. Основные его компоненты - ламинин, коллаген IV, протеингликаны, энтактин и нидоген.

Клеточные линии метастатической меланомы кожи человека mel Cher, mel P, mel Si, mel Bgf, mel Ch, mel Kor, mel Mtp, mel Il, mel Ksen, mel Me, mel Gus, mel Ibr, mel R были проверены в исследовании in vitro на возможность формирования сосудистоподобных структур ВМ. В качестве сравнения была взята клеточная линия SVEC-4-10 эндотелиальных клеток мыши, поскольку тест на образование сосудистоподобных структур in vitro был изначально разработан для выявления ингибиторов и активаторов ангиогенеза. При проведении этого исследования эндотелиальные клетки, прикрепляясь к гелю, имитирующему внеклеточный матрикс, формировали структуры, схожие с ангиогенными in vivo.

Культивирование клеток метастатической меланомы кожи в низкой плотности на Матригеле приводило к формированию сосудистоподобной структуре (СПС) через 10-16 ч (рис. 5.1-5.2).

melan_r5.1.jpg
Рис. 5.1. Формирование нестабильных сосудистоподобных структур, увеличение х200: А - клеточная линия mel Il, Б - клеточная линия mel Kor, B - клеточная линия mel Mtp, Г - клеточная линия mel Gus

melan_r5.2.jpg
Рис. 5.2. Клеточные линии с низкой способностью формировать СПС, увеличение х200: Формирование клеточной линией mel Ksen кластеров клеток (A) и СПС (Б), клеточной линией mel Ibr кластеров клеток (B) и СПС (Г), клеточной линией mel Me кластеров клеток (Д) и СПС (Е)

Существовало ли отличие в краткосрочных тестах на формирование сосудистоподобной структуры между клеточными линиями метастатической меланомы кожи? Да, но не очень существенное.

Следует отметить, что mel Cher, mel Si, mel Bgf, mel P, mel Ch, mel R образовывали стабильные сосудистоподобные структуры, структура которых была сохранена через 24 ч (рис. 5.1, А-Г). В этом случае опухолевые клетки, культивированные на Матригеле, образовывали длинные, соединенные друг с другом трубочки, отсутствовали незамкнутые трубочки, не ограниченные контактами с другими клетками.

Несколько клеточных линий (mel Kor, mel Il, mel Gus, mel Mtp) формировали нестабильные СПС, а часть клеточных линий формировали сосудистоподобные структуры не всегда. Нестабильными СПС были названы потому, что через 20-24 ч инкубации на Матригеле начинали разрушаться контакты между клетками, появлялись разрывы контактов, нарушалась вытянутая структура сосудистоподобной структуры (ibid.).

Изученные клеточные линии mel Ksen, mel Ibr, mel Me обладали низкой способностью к формированию СПС. В этом случае образование сосудистоподобной структуры не воспроизводилось от опыта к опыту, и часто зависело от наличия или отсутствия монослоя культуры клеток, взятых для эксперимента (рис. 5.2, А-Е). При этом опухолевые клетки, не формирующие сосудистоподобные структуры, образовывали малые кластеры клеток с короткими прерывающимися трубочками.

Таким образом, мы подтвердили, что при культивировании высокоагрессивных опухолевых клеток метастатической меланомы кожи на гелевых матриксах в течение 16-24 ч происходило формирование сосудистоподобных структур.

Способность клеток метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии

Чем же вызвана способность клеток метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии? Одно из объяснений способности опухолевых клеток участвовать в микроциркуляции - их пластичность. Ведь опухолевые клетки в стадии роста новообразования претерпевают определенную дифференцировку. Опухоль, моноклональная по своей природе, в процессе малигнизации приобретает все больший клеточный полиморфизм. Профиль генов, экспрессируемых агрессивными клетками меланомы кожи и глаза, при развитии васкулогенной мимикрии изменяется.

Так, он может быть сходен с эндотелиальными, стволовыми клетками и клетками других типов. Многие белки, которые высоко экспрессируются в агрессивных опухолевых клетках, участвуют в процессах ангиогенеза и васкулогенеза. К ним относятся VE-кадхерин (СD144), EphA2, ламинин 5у2.

Было показано в экспериментах in vitro, что уменьшение экспрессии VE-кадхерина, EphA2 или ламинина 5у2 приводит к полной неспособности агрессивных клеток меланомы формировать васкулогенные структуры на внеклеточных матриксах. А моноклональные антитела к VE-кадхерину ингибируют ангиогенез в опухоли Льюиса и эпидермоидных опухолях.

Считается, что тирозинкиназный рецептор EphA2 важен для развития васкулогенной мимикрии при меланоме. Высокий уровень экспрессии EphA2 и эфрина A1 ассоциируются с ростом меланомы, толщиной опухоли и более низкой выживаемостью больных. Связывание ее с лигандом, эфрином A1, приводит к фосфорилированию и активированию нижележащих сигнальных путей, которые в свою очередь усиливают пролиферативную активность опухоли.

Нельзя обойти вниманием и семейство VEGFR. Известно, что VEGFA обладает способностью запускать полную последовательность событий, ведущих к росту новых сосудов, и может стимулировать ангиогенез in vivo. VEGF А связывается с тирозинкиназными рецепторами VEGFR-1 и VEGFR2.

В проведенных нами исследованиях на клеточных линиях метастатической меланомы кожи анализ экспрессии VEGFA и его рецепторов показал высокую экспрессию белков данного семейства (рис. 5.3).

melan_r5.3.jpg
Рис. 5.3. Экспрессия VEGF и его рецепторов опухолевыми клетками линии mel Cher, увеличение х200: А - экспрессия VEGF, Б - экспрессия VEGFR-1, В - экспрессия VEGFR-2

Однако, в опухолевых клетках отсутствовало окрашивание антителами к VEGFR-2, фосфорилированному по Tyr 951 (основной сайт аутофосфорилирования для VEGFR-связывающих белков) и Tyr1175 (основной сайт аутофосфорилирования для VEGF-А) доменам. При анализе особенностей экспрессии белков линиями из разных групп возможной взаимосвязи изменения формирования сосудистоподобной структуры с изменением уровня экспрессии VEGF А не выявлено.

Далее была исследована способность клеточных линий метастатической меланомы кожи mel Cher, mel P и mel Ch, стабильно формирующих сосудистоподобные структуры, экспрессировать VE-кадхерин, эфрин А2 (EphA2) и белки базальных мембран.

Клетки изученных линий метастатической меланомы кожи экспрессировали эфрин А2, локализация окрашивания - цитоплазма клетки (табл. 5.1).

Таблица 5.1. Экспрессия клетками линий меланомы кожи эфрина A2 и VE-кадхерина

melan_t5.1.jpg

Три клеточные линии метастической меланомы кожи, стабильно формирующие СПС (mel Cher, mel P и mel Ch), экспрессировали неодинаково белок гомотипического узнавания и клеточной адгезии VE-кадхерин, который участвует в процессе васкулогенной мимикрии. Так же VE-кадхерин, как белок адгезии, специфичен для эндотелиальных клеток. VE-кадхерин принадлежит к семейству трансмембранных протеинов и способствует гомотипическому межклеточному взаимодействию.


Опухолевые клетки линии mel Ch не экспрессировали VE-кадхерин, а для клеток линии mel P показано слабое цитоплазматическое окрашивание 90%. Однако выявлено, что цитоплазматическая экспрессия VE-кадхерина характерна для 100% опухолевых клеток линии mel Cher.

Исследование белков базальных мембран

Исследование белков базальных мембран показало, что 90% клеток клеточной линии mel Cher экспрессировали ламинин 5у2 (табл. 5.2). Ламинин 5у2, по данным некоторых авторов, считается тригерром прогрессии меланомы.

Таблица 5.2. Экспрессия белков базальных мембран клетками линий меланомы кожи

melan_t5.2.jpg

Это позволило выделить клеточную линию метастатической меланомы кожи mel Cher для дальнейших экспериментов по созданию положительной модели васкулогенной мимикрии. На момент создания модели ВМ, основной зарубежной линией для изучения васкулогенной мимикрии являлась клеточная линия увеальной меланомы человека MUM2B, которая формирует СПС in vitro в долгосрочных (до двух недель) тестах. Формирование ВМ in vivo происходит лишь при определенных (имплантации сфероидов клеток) условиях.

По данным Maniotis A. J., at al., при культивировании высокоагрессивных опухолевых клеток на внеклеточных матриксах в течение длительного периода времени происходило формирование тубулярных структур. Такие структуры начинали образовываться на первый день эксперимента, на 14 день микроинъекция контрастирующего агента в такие каналы in vitro показывала способность проводить контраст.

melan_r5.4.jpg
Рис. 5.4. Формирование тубулярных структур, увеличение >200: А - начало формирования тубулярных структур клеточной линией mel Cher на 5 день инкубации на Матригеле, Б - отсутствие формирования клеточной линией mel Me тубулярных структур при инкубации на Матригеле, В - формирование тубулярных структур клеточной линией mel Cher на второй неделе инкубации, Г - PAS-окрашивание тубулярных структур

Клеточная линия mel Cher в долгосрочных экспериментах на двух внеклеточных матриксах, Матригеле и фибронектине, формировала тубулярные структуры. Тубулярные структуры представлены на рис. 5.4 A и В. Для данных структур характерна положительная PAS-реакция, что свидетельствует о присутствии белков базальных мембран.

PAS-окрашивание тубулярных структур, сформированных опухолевыми клетками клеточной линии метастатической меланомы кожи mel Cher, представлено на рисунке 5.4 Г. Для сравнения была взята клеточная линия из третьей группы - mel Me, относящаяся к группе линий с низкой способностью формировать сосудистоподобные структуры. Клетки линии mel Me не были способны формировать тубулярные структуры при инкубации на Матригеле или фибронектине (рис. 5.4 Б).

melan_r5.5.jpg
Рис. 5.5. Исследование подкожных ксенографтов линии mel Cher, увеличение х200: А - гистологическое исследование опухоли, окрашивание гематоксилин-эозином, Б - CD34+ сосуды 

Наши исследования показали, что клеточная линия mel Cher может быть использована и в качестве модели для исследования васкулогенной мимикрии in vivo. Исследование феномена ВМ на бестимусных мышах проводилось впервые в мире. Для имплантации мышам оптимальным количеством опухолевых клеток, взятым из культуры in vitro, можно считать 3х106. В случае имплантации 5х106 опухолевых клеток отмечена лучшая воспроизводимая динамика роста подкожных ксенографтов, но также отмечено и появление некрозов. В легких иммунодефицитных мышей при окрашивании гематоксилин-эозином парафиновых срезов не выявляются метастатические очаги (рис. 5.5 A).

Морфологический и иммуногистохимический анализ проводили на срезах опухолей, полученных на 25 день после перевивания. При гистологическом исследовании опухоль состояла из пласта средних, полиморфных клеток, разделенных узкими прослойками соединительной ткани.

В некоторых опухолевых клетках наблюдалось наличие небольшого количества пигмента (меланина). Ядра опухолевых клеток были овально-округлой формы, встречались немногочисленные сосуды. Среднее количество CD34+ сосудов в опухоли было равно 8+2 сосуда в поле зрения (рис. 5.5 Б).

В качестве оптимального подхода для исследования ксенографтов любых клеточных линий на ВМ мы предлагаем следующую схему гистохимического исследования:

- исследование PAS-структур (метод PAS-окрашивания);
- исследование ВМ-структур и сосудистой плотности опухоли (метод комбинированного CD31/CD34/PAS-или CD34/PAS-окрашивания).

Важным является наличие в ткани опухоли PAS+ параллельных с пересечением каналов, петель и/или сетей. Наличие CD34-/PAS-+ структур свидетельствует о васкулогенной мимикрии.

Проведено окрашивание срезов опухоли реактивом Шиффа на наличие базальных мембран (рис. 5.6).

melan_r5.6.jpg
Рис. 5.6. Окрашивание подкожных ксенографтов на наличие базальных мембран, увеличение х200: A - PAS+ параллельные каналы (стрелки), Б - PAS+ параллельные с пересечением каналы (стрелки), В - ламинин+ параллельные с пересечением каналы (стрелки), Г - ламинин+ петли и арки (стрелки)

Данное окрашивание выявляет соединительную ткань, базальную мембрану ангиогенных сосудов (состоящих из эндотелиальных клеток) и структуры васкулогенной мимикрии, представляющие собой каналы, окруженные клетками опухоли.

Комбинированное PAS-окрашивание на наличие базальных мембран и иммуногистохимическое исследование на маркер CD34 показало, что не все PAS-положительные структуры окрашивались антителами к CD34, что является признаком васкулогенной мимикрии в опухолевой ткани подкожных ксенографтов (рис. 5.7).

melan_r5.7.jpg
Рис. 5.7. Комбинированное CD34/PAS-окрашивание: А - комбинированное CD34/PAS-окрашивание, х200, выявление CD34-/PAS+-структур (ВМ-структур, стрелка), Б - ВМ-структура (стрелка), х400

Комбинированное CD34/PAS-окрашивание представлено на рис. 5.4. Был проведен анализ пролиферативной активности опухолевой ткани подкожных ксенографтов и анализ экспрессии VEGF и его двух рецепторов (VEGFR-1 и VEGFR-2). В результате иммуно-гистохимического анализа опухолевой ткани подкожных ксенографтов была выявлена высокая экспрессия рецепторов сосудистого фактора роста VEGF (рис. 5.8).

Отметим, что при повышении VEGFA увеличивается экспрессия VEGFR-1, что свидетельствует об активации сигнальных механизмов, запускаемых данным рецептором, приводящим к усилению миграционного потенциала опухолевых клеток, реализуемого через PI3K и ERK.

Для VEGF характерно цитоплазматическое окрашивание средней интенсивности. Ядерная экспрессия Ki-67 была характерна для 30-40% клеток опухоли (рис. 5.8 Г).

melan_r5.8.jpg
Рис. 5.8. Экспрессия VEGF и его рецепторов, маркера пролиферации Ki-67, х200: А - экспрессия VEGF, Б - экспрессия VEGFR-2, В - экспрессия VEGFR-1, Г - экспрессия Ki-67

Таким образом, клеточную линию mel Cher можно рассматривать как модель для изучения васкулогенной мимикрии in vitro и in vivo. Экспериментальная модель васкулогенной мимикрии, клеточная линия mel Cher, запатентована и рекомендуется для исследования феномена васкулогенной мимикрии в качестве положительной модели.

Разработаны и специальные экспериментальные подходы для исследования изменения экспрессии белков ВМ в момент формирования сосудистоподобных структур на Матригеле. Различная способность клеточных линий метастической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии является в данном случае преимуществом.

И.Н. Михайлова, М.М. Давыдов
Похожие статьи
показать еще
 
Категории