Раздел медицины:

Онкология

Получение, культивирование, кариотип клеточных линий меланомы кожи

28 Апреля в 7:22 533 0

Получение и культивирование клеточных линий меланомы человека

Клеточные линии культивируют в смеси питательных сред RPMI (80%), ТЭС (20%), L-глутамина, 1%-го HEPES, гентамицина, комплекса аминокислот и витаминов (Flow Lab., USA) В культуральные флаконы объемом 25 см3 в 5 мл среды засевают 1х106 клеток.

Температура культивирования + 37 °С.

Монослой клеток формируется через 3-4 дня.

При посевной концентрации 70-100 тыс. клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимают с использованием стандартных растворов (0,25%-й р-р трипсина и 0,02%-й р-р Версена) в соотношении 1 : 1. При посевной концентрации 500 000 клеток/мл индекс пролиферации через 48 ч культивирования составляет 3,6-4,6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания (RPMI (80%), ТЭС (20%), ДМСО (10%)). Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1 °С в минуту до -25 °С, затем быстрое замораживание до -70 °С. Хранение в жидком азоте при температуре -196 °С. Размораживание быстрое, при +37 °С.

Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% ТЭС, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см3. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания должна составлять не менее 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на наличие микоплазм отрицателен.

Характеристика полученных культур меланомных клеток

Культура, прошедшая не менее 20 пассажей, рассматривалась нами в дальнейшем как клеточная линия. Получено 19 стабильно растущих клеточных линий меланомы кожи человека. Каждой клеточной линии было дано название, которое соответствовало первым буквам фамилии или имени отчества пациента, за исключением одной, mel P (табл. 1.1). Количество пассажей, указанных в таблице, соответствует моменту депонирования клеточной линии.

Таблица 1.1. Клеточные линии меланомы кожи человека

melan_t1.1.jpg

Цитоморфология клеточных линий

Из образцов, которые были взяты у 19 пациентов различных отделений НИИ КО РОНЦ с диагнозом «метастатическая меланома кожи», получено 19 стабильно растущих клеточных линий. Они различны как по характеру роста в культуре, так и по цитоморфологическим признакам.

Большинство культур имели монослойный характер роста пласта. Нередко наблюдается образование колоний, являющихся центром роста клеточного монослоя. Отдельные клеточные линии имеют полусуспензионный характер роста: часть клеток росла, прикрепляясь к поверхности пластика, а часть из них оставалась во взвешенном состоянии (рис.1.1).

melan_r1.1.jpg
Рис. 1.1. Клеточная линия mel Gi (фото культуры, х 100)

Изучение цитограмм клеточных линий выявило разнообразие цитоморфологической характеристики опухолевых клеток. Преимущественно клеточные линии состоят из клеток трех видов: эпителиоподобных, веретенообразных, невусоподобных или их сочетаний.

Линии различаются:

- по степени полиморфизма и атипии;
- по количеству пигмента, митозов, гигантских многоядерных и одноядерных клеток.

В некоторых линиях (из эпителиоподобных клеток) присутствует большое количество гигантских многоядерных клеток, беспорядочно разбросанных среди одноядерных клеточных элементов.

Одна из эпителиоподобных клеточных линий, mel R, состоит преимущественно из перстневидноподобных клеток различного размера, частично - из клеток с ядрами округлой и овальной форм с 1-3 митозами в поле зрения.

Цитограммы веретеноклеточной меланомы характеризуются клетками вытянутой и веретенообразной формы с короткими или длинными отростками цитоплазмы, иногда переплетающимися с другими цитоплазматическими волоконцами. В небольшом количестве присутствуют многоядерные клетки с 3-5 ядрами, которые отличаются по строению от гигантских многоядерных клеток эпителиоподобной меланомы.

Встречаются клеточные линии, состоящие из невусоподобных клеток. В них обнаруживаются средние и мелкие клетки овальной, удлиненной и многоотросчатой форм. Среди полученных клеточных линий пигмент в цитоплазме присутствовал в четырех культурах.

В цитограммах линий клеточные элементы с морфологическими признаками лимфоцитов не обнаружено.

В результате цитоморфологического исследования выделено три группы, классифицированные как (табл. 1.2):

- высокодифференцированные;
- умеренно дифференцированные;
- низкодифференцированные.

Таблица 1.2. Степень дифференцировки опухолевых клеток полученных линий

melan_t1.2.jpg

Высокодифференцированные клеточные линии mel Si, mel Me представлены относительно мономорфными клетками небольшого размера, с небольшим количеством гигантских многоядерных клеток; митозы практически отсутствуют.

Умеренно дифференцированные mel Bgf, mel Il, mel P, mel R, mel Ksen, mel Z, mel Hn представлены полиморфными клетками: мелкими средними и крупными; с интенсивно базофильной цитоплазмой, без четких контуров или с фестончатыми краями с эксцентрично или центрально расположенными ядрами с грубоглыбчатым гиперхромным хроматином и одним, редко - 2-3 ядрышками. Гигантские многоядерные клетки немногочисленны; умеренное количество клеток находится в митозе.

Низкодифференцированные клеточные линии mel Kor, mel Gus, mel Mtp, mel Is, mel Gi, mel Ibr, mel Cher, mel Ch, mel H, mel Rac представлены резко полиморфными клетками, с множеством гигантских уродливых клеток и ядер. Выявлено большое количество округлых, овальных, удлиненных, неправильных ядер с неровными контурами.

Хроматин грубо глыбчатый, ядерная оболочка утолщена и неровная; ядрышки в количестве от одного до шести в ядре; выраженная гиперхромия. Отмечены атипичные многочисленные митозы.

Получено 19 клеточных линий, адаптированных к росту in vitro из метастатических образцов меланомы человека. Клеточные линии обладают стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Для исследования клеточных линий использованы методы иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР. Клеточные линии прошли более 30 пассажей, это характеризует их (клетки) как обладающие неограниченным жизненным потенциалом.

Это позволило создать рабочий и посевной банк стабильно растущих клеточных линий. Клеточные линии хранятся в банке криоконсервации биоматериалов ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России в жидком азоте при температуре -196 °С в созданном рабочем и посевном банке. 16 клеточных линий хранятся в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Кариотип клеточных линий меланомы человека

В последнее время стало очевидно, что не только для лейкозов, но и для ряда других опухолей значение в практической медицине имеет выявление цитогенетических аномалий.


Во-первых, выявление кариотипически аномального клона почти всегда свидетельствует о злокачественности опухоли.

Во-вторых, некоторые генетические аномалии характерны для определенных заболеваний, что помогает в дифференциальной диагностике.

В-третьих, результаты цитогенетического анализа опухоли помогают в прогнозе, а иногда - и в выборе тактики лечения.

В клеточных линиях меланомы обнаружены разнообразные хромосомные нарушения. Некоторые являются специфичными для меланомы, что связано с наличием в перестроенных хромосомах генов, участвующих в инициации или прогрессии меланомы. Другие встречаются в клетках разных типов опухолей.

Так, например, в локусе 9p21 расположен ген-супрессор опухоли CDKN2A (p16), который играет роль при многих злокачественных новообразованиях. Он кодирует белок, участвующий в регуляции клеточного цикла и клеточного старения.

Потеря гетерозиготности в этом локусе обнаружена не только в тканях меланомы, но и в диспластических невусах, и даже в доброкачественных невусах. Это означает, что потерю гетерозиготности в этом локусе можно выявить даже в предполагаемых предраковых очагах, т. е. до появления гистологических признаков опухоли. Кроме того, мутации этого гена характерны для семейной меланомы.

Нарушения хромосомы 10 часто встречаются в клетках меланомы человека, чаще всего это потеря целой хромосомы. Показано, что локус на длинном плече хромосомы 10 дистальнее 10q23.1 содержит ген-супрессор опухоли PTEN (фосфатаза), который отвечает за сильное торможение кинетики формирования меланомы. В свою очередь, участок на коротком плече 10p15.3 также оказывает эффект на рост меланомы in vivo, хотя и менее выраженный (эта область содержит ген-супрессор и для других опухолей, рака простаты и глиобластомы). Таким образом, потеря обоих участков, возникающая при моносомии по хромосоме 10, приводит к более значимому ускорению роста, чем при потере одного из локусов.

Потеря длинного плеча хромосомы 6 и, следовательно, локуса 6q22, в котором находится ген WISP3, приводит к гиперэкспрессии Rhoc ГТФ-азы, необходимой для метастазирования и инвазии опухолевых клеток. Часто потеря длинного плеча сочетается с увеличением копий короткого плеча хромосомы 6, где локализован ген NEDD9 (6p24.1), отвечающий за метастазирование меланомы.

Некоторые генные нарушения ассоциированы с метастазированием опухоли и низкой выживаемостью. В частности, рецепторы тирозинкиназ играют важную роль при различных злокачественных новообразованиях. Один из них - рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) - может вызывать или усиливать злокачественную трансформацию клеток при меланоме. Ген EGFR расположен на хромосоме 7 в районе 7p12.3-p12.1.

Кроме того, повышение экспрессии данного гена может играть важную роль в метастазировании меланомы, т. к. по сравнению с первичной опухолью, экспрессия гена в метастазах выше. Это отражается полисомией по хромосоме 7, также более выраженной в метастазах. При наличии в клетках опухоли перестроек, затрагивающих хромосомы 7 или 11, выживаемость пациентов ниже по сравнению с теми, в опухолях которых эти хромосомы нормальные.

В настоящее время для исследования опухолей все чаще используются молекулярно-цитогенетические методы, такие как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH). FISH на интерфазных клетках используется для изучения выявленных ранее хромосомных аномалий в опухолях хорошо изученных типов. Для исследования новых случаев больше преимуществ имеет метод CGH. Однако, несмотря на методические трудности, классическое цитогенетическое исследование опухолей, в том числе меланомы, позволяет получить данные, которые не дают FISH или CGH.

Проведено цитогенетическое исследование 19 клеточных линий меланомы различной степени дифференцировки. Фиксацию клеток проводили стандартным способом. Готовые препараты окрашивали по G-методу.

Все изученные культуры характеризовались измененным хромосомным набором - как по числу хромосом, так и по структуре последних. Модальное число хромосом соответствовало околодиплоидному и околотриплоидному. В некоторых культурах встречались клетки с удвоенным по сравнению с основным пулом клеток числом хромосом (тетра- и гексаплоидные).

Эти культуры характеризовались различающимися диаметрами ядер при одних и тех же плотности окраски и состоянии хроматина, характерных для интерфазных ядер. Принимая во внимание дублированность структурных аномалий хромосом (например, кольцевой хромосомы), можно утверждать: речь идет не о двух различных линиях клеток в одной культуре, а о повышенной плоидности в них.

Таблица 2.1. Кариотип клеточных линий меланомы

melan_t2.1.jpg

При кариотипировании выявлено, что в высокодифференциро-ванных клеточных линиях mel Me, mel Si модальное число хромосом соответствовало околодиплоидному набору (46-49 в клетках культуры mel Si и 47-50 в mel Me). Общее число идентифицированных хромосомных повреждений, включая структурные и числовые (анеусомии), составило в обеих культурах 4 на 1 клетку.

В умереннодифференцированных клеточных линиях mel Il, mel P, mel Bgf число обнаруженных хромосомных аномалий в культурах составило от 5 до 7 на 1 клетку; линии были различной плоидности: ди-, три- и тетраплоидные. В низкодифференцированных клеточных линиях (mel Kor, mel Gus, mel Mtp, mel Is, mel Gi, mel Ibr, mel Cher, mel Ch, mel H, mel Rac) в 6 культурах модальное число хромосом соответствовало триплоидному набору, в 3 - тетраплоидному и 1 была околодиплоидной. Число идентифицированных структурных и числовых хромосомных аномалий в большинстве низкодифференцированных культур было больше 5 на 1 клетку, в частности, в диплоидной культуре mel Gus достигло 11.

Меньшее количество выявленных нарушений в некоторых линиях связано с затрудненным анализом метафаз с большим количеством хромосом, а также малым количеством митозов в некоторых культурах. Обнаружен также высокий уровень нестабильных хромосомных аберраций: хроматидные обмены, ди- и трицентрические хромосомы, кольцевые хромосомы, клетки с множественными аберрациями.

Среди крайне разнообразных числовых и структурных хромосомных нарушений (транслокации, делеции, дупликации, инверсии, кольцевые хромосомы, изохромосомы, маркерные хромосомы), некоторые встречались с высоким постоянством, в том числе: полисомия по хромосоме 7, полисомия по короткому плечу хромосомы 6, моносомия по короткому плечу хромосомы 9, различные транслокации с участием хромосомы 1.

И.Н. Михайлова, М.М. Давыдов
Похожие статьи
показать еще
 
Категории