Раздел медицины:
Онкология

Генотип клеточных линий меланомы кожи

1462 0
В последнее время достигнуты значительные успехи в понимании патогенеза меланомы.

Меланома отличается генетической нестабильностью и повышенным уровнем соматических мутаций по сравнению с другими солидными опухолями.

При полногеномном секвенировании соматические мутации выявлены в 86% образцов меланомы в 43 из 46 генов, ассоциированных с канцерогенезом.

Гены в патогенезе меланомы

Основная роль в патогенезе меланомы принадлежит MAPK (mitogen-activated protein kinase) сигнальному пути - ключевому регулятору клеточной пролиферации, дифференцировки, выживания, подвижности и ангиогенеза. МAPK сигнальный путь участвует в передаче сигнала от различных внешних стимулов (ростовые факторы, цитокины, гормоны и стрессы) к внутриклеточным белкам через серию событий, включающих фосфорилирование и белок -белковое взаимодействие.

Гиперактивация MAPK-сигнального пути наблюдается в 90% случаев меланомы и это достигается за счет активации различных участков каскада RAS-RAF-MEK-ERK. Регуляция MAP киназного пути происходит различным образом. Усиление сигналинга ERK происходит в результате активирующих мутаций или амплификации генов, кодирующих компоненты RAS-RAF-MEK-ERK пути. В меланоме кожи наиболее часто определяются точечные мутации в генах BRAF (50-70%) или NRAS (15-30%). Молекулярная классификация учитывает локализацию первичного узла (очага) меланомы, генетические изменения в опухоли и экспозицию ультрафиолетовому облучению.

Ген BRAF кодирует серинтреониновую киназу BRAF, мутации в активирующем домене которой, вызывают каскадную активацию протеинкиназ MEK и ERK. Серин-треониновые киназы MEK1 и MEK2 катализируют фосфорилирование по треонину и тирозину белков ERK1 и ERK2, которые имеют много цитоплазматических и ядерных субстратов. Активация последних вызывает усиление клеточной пролиферации, дифференцировки, выживания, подвижности и ангиогенеза.

В 80% случаев меланомы с мутацией гена BRAF выявляется нуклеотидная замена T1799A, приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в кодоне 600 (V600E). В 20% случаев встречается замена V600K, редко - замены V600R/D/M. Мутации в киназном домене приводят к конформационным изменениям и повышению активности BRAF киназы в 70-130 раз in vivo. При других мутациях в 14 или 15 экзонах (кодоны L597, K601) активность BRAF киназы составляет лишь 30% от активности фермента с мутацией V600E.

Для лечения BRAF-положительной меланомы кожи одобрены для клинического применения и зарегистрированы препараты: вемурафениб (2011 г.), блокирующий димеризацию протеинкиназы BRAF с мутацией V600E и дабрафениб (2013 г.), который ингибирует BRAF с мутацией V600E/K, блокируя АТФ-связывающий сайт киназного домена, а также ингибиторы нижележащей киназы МЕК - траметининиб и кобиметиниб.

Вторым наиболее часто мутирующим геном в меланоме является ген NRAS. Белок NRAS относится к семейству малых ГТФ-связывающих белков и, в отличие от BRAF, активирует не только каскад RAF-MEK-ERK, но и другие сигнальные пути: Ral-GDS, PI3K-AKT-mTOR и PLC-PKC.

Мутации NRAS выявлены в 15-18% меланомы кожи. Большинство (80%) мутаций затрагивают кодон Q61 в 3 экзоне NRAS: нуклеотидная замена C436A приводит к замене глутамина на лизин (Q61K), а мутация A437G - к замене глутамина на аргинин (Q61R). Реже возникают мутации во 2 экзоне NRAS в кодонах G12, G13.

Часто в образцах меланомы, содержащих гены BRAF и NRAS дикого типа, амплифицированы гены CDK4 и OGND1 (циклина D1), кодирующие нижележащие субстраты ERK. Ген CDK4 кодирует цик-лин зависимую киназу CDK4, входящую в комплекс CDK4/6. Нарушения гена CDK4, как и гена CDKN2A, встречаются в соматических меланомах, а герминальные мутации ассоциированы с риском развития семейной меланомы кожи. Наследственные активирующие мутации гена CDK4 делают комплекс CDK4/6 устойчивым к ингибированию p16INK4a.

В 20-40% случаев семейной меланомы найдены мутации генасупрессора CDKN2A, кодирующего белки p14ARFH p16INK4a. Помимо наследственных мутаций в 50% образцов меланомы встречаются соматические мутации и эпигенетические изменения p16INK4a. Низкая экспрессия p16INK4a коррелирует с прогрессией заболевания, усилением пролиферации и плохим прогнозом при спорадической меланоме.

Инактивация p16INK4a приводит к активации cyclin D/CDK4 и фосфорилированию pRB1, что ведет к активации клеточного цикла и пролиферации клеток. Мутации p14ARF приводят к недостатку белка p53, который контролирует целостность и репарацию ДНК. Мутации гена TP53 встречаются в 16% случаев меланомы кожи, часто в опухолях с мутациями BRAF или NRAS.

Для развития меланомы важным событием является активация сигнального пути PI3K-AKT-mTOR, причем, уровень активности AKT3 повышается с увеличением стадийности меланомы. Активация серин-треониновой киназы AKT3 отмечена в 60% случаев спорадической меланомы: в 35% случаев за счет амплификации гена AKT3, а в 5% - за счет мутации гена PI3KGA.

В 40-60% меланомы наблюдается инактивация фосфатазы PTEN, которая негативно регулирует PI3K-AKT сигналинг. Подавление экспрессии PTEN происходит в результате мутации кодирующего гена, потери гетерозиготности или утраты хромосомного локуса, либо в результате эпигенетических нарушений транскрипции гена за счет метилирования или микро-РНК регуляции.


Активация PI3K-AKT пути важна для прогрессирования невуса в меланому. Усиленная экспрессия онкогенных белков NRAS или BRAF недостаточна для трансформации нормальных меланоцитов. В процессе развития меланомы имеет место кооперация амплификации гена AKT3 и мутации BRAF.

Мутации генов и меланома кожи

Другие пути, регуляция которых нарушена при меланоме, включают ген KIT. Этот ген кодирует тирозинкиназный рецептор KIT фактора роста стволовых клеток (SCF), который играет ключевую роль в эмбриогенезе меланоцитов, их дифференцировке и пролиферации. В результате взаимодействия с лигандом SCF, рецептор KIT активирует ряд сигнальных путей (RAS-MAPK, PI3K-AKT, SRK и другие), усиливая клеточный рост, пролиферацию, инвазию, метастазирование и ингибируя апоптоз.

Мутации гена KIT встречаются в 2-6% меланомы кожи. Рецептор KIT экспрессируется на ранних стадиях меланомы более, чем в 50% случаев, однако по мере прогрессирования и перехода меланомы в инвазивные стадии, экспрессия KIT утрачивается, что предполагает супрессорные функции KIT. Действительно, трансфекция гена KIT в высоко метастатическую линию клеток меланомы A375SM ведет к уменьшению роста опухоли и метастазов при последующем введении этих клеток мышам.

Введение фактора роста стволовых клеток SCF - лиганда рецептора KIT, приводит к высокому уровню апоптоза в KIT-позитивной линии клеток меланомы. Потеря экспрессии KIT коррелирует со злокачественной трансформацией меланоцитов, инвазией и метастазированием опухоли. В небольшом проценте случаев меланомы кожи с диким типом BRAF и NRAS выявлены опухоли с гиперэкспрессией KIT и CDK4.

Мутации KIT не встречаются одновременно с мутациями NRAS или BRAF. Мутации KIT чаще всего представлены точечными заменами в экзоне 11, кодирующем регуляторный JM-домен рецептора, и реже заменами в экзонах 9, 13, 17 и 18. Тирозинкиназный ингибитор иматиниба мезилат эффективен при лечении меланомы кожи, если мутантный белок KIT к нему чувствителен, обычно вследствие мутаций в экзонах 11 или 13 кодирующего гена.

Случаи меланомы с мутациями BRAF и NRAS отличаются по клинико-морфологическим характеристикам и клиническому поведению.

Опухоли с мутациями NRAS чаще имеют больший размер и более высокий митотический индекс. Такие меланомы отличаются большей толщиной, чем опухоли с диким типом гена или мутацией BRAF и, по-видимому, связаны с вертикальной фазой роста меланомы. Трансфекция гена RAS в клеточные линии меланомы с эпителиоидно клеточной морфологией усиливает продукцию протеазы и клеточную подвижность, черты, характерные для фазы вертикального роста меланомы.

Наличие мутаций BRAF ассоциировано с более частым изъязвлением опухоли, с более частым развитием местных рецидивов и поражением регионарных лимфатических узлов, частота мутаций BRAF выше у пациентов с выживаемостью менее 5 лет. Мутации BRAF ассоциированы с более ранним временем постановки диагноза, чем NRAS. Пациенты с меланомой и мутациями BRAF значительно моложе (49,8 лет), чем с мутациями NRAS (55,7 лет), или диким типом этих генов (59,5 лет) и это отличие статистически достоверно.

Мутации NRAS чаще присутствуют в меланоме кожи, связанной с хроническим солнечным повреждением. Также мутации NRAS выявляют в 94,7% случаев врожденных меланоцитарных новообразований, которые характеризуются повышенным риском трансформации в меланому. Показано, что мутации NRAS связаны с низкой общей выживаемостью и являются независимым признаком более короткого выживания у пациентов с меланомой IV стадии.

Нами проведен анализ мутаций генов BRAF и NRAS в 19 культурах клеток меланомы. Мутация BRAF обнаружена в 13 клеточных линиях: в 10 выявлена замена V600E, в двух V600K и в одной -L597Q (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Мутации BRAF и NRAS в клеточных линиях меланомы 

melan_t4.1.jpg

Среди культур клеток меланомы с мутацией BRAF V600E/K большинство клеточных линий было низко (6) или умеренно (6) дифференцированны. Одна линия высокодифференцированных клеток меланомы (mel Si) содержала мутацию BRAF L597Q. Мутация NRAS Q61K выявлена в 4 линиях клеток меланомы, из которых 3 культуры были низко дифференцированных и одна - высоко дифференцированных клеток. В одной культуре низко дифференцированных клеток меланомы выявлена мутация NRAS Q61R. В культуре mel Ksen умеренно дифференцированных клеток мутации BRAF и NRAS не обнаружены.

И.Н. Михайлова, М.М. Давыдов
Похожие статьи
показать еще
 
Категории