Раздел медицины:

Онкология

Нейрофиброматоз II типа (акустическая невринома) обусловленный дефектами в онкогенах

08 Августа в 12:30 219 0
По оценкам разных авторов, частота нейрофиброматоза II типа составляет 1 : 33-40 тысяч.

Болезнь дебютирует в среднем в возрасте 21-22 лет.

Наследование нейрофиброматоза II типа имеет те же особенности, что и при заболевании I типа, хотя и менее выраженные.

Пенетрантность заболевания превышает 95%. Часто болезнь развивается в результате возникновения новых мутаций (по нашим оценкам, в 65% случаев). Однако в соответствии с литературными данными скорость мутирования в гене NF2 меньше, чем в гене NF1, и составляет в среднем 6.5x10 е. Геномный импринтинг выражается в более раннем дебюте заболевания при получении мутантного аллеля от матери, по сравнению с теми пациентами, которые унаследовали свою мутацию от отца, - в среднем в 18 и 24 года соответственно (Evans et al., 1992).

Тяжесть течения заболевания также достоверно коррелирует с материнским наследованием (Baser et al., 2001). В ряде семей наблюдается антиципация. Так, описана семья, в которой на протяжении 5 поколений прослежено рождение пациентов с доминантно наследуемой акустической невриномой, при этом средний возраст гибели больных во втором поколении был равен 72 годам, в третьем поколении составил 63 года, в четвертом - 42 года и в пятом - 28 лет (Gardner, Frazier, 1933).

Соматический мозаицизм играет важную роль в патогенезе нейрофиброматоза II типа, что необходимо учитывать при молекулярной диагностике заболевания, прогнозировании и медико-генетическом консультировании (Kluwe, Mautner, 1998). Под нашим наблюдением состоят 48 семей (79 больных), в 35% случаев наблюдается семейный характер заболевания.

Нейрофиброматоз II типа характеризуется развитием билатеральных неврином VIII пары черепно-мозговых нервов или реже дорзальных корешков спинного мозга, а также менингиом. Только у небольшой части больных выявляются единичные «кофейные» пятна и опухоли периферических нервов. Важными дополнительными диагностическими критериями нейрофиброматоза II типа являются субкапсулярные катаракты и гамартомы сетчатки.

Таким образом, для постановки диагноза небходимо либо наличие двустороннего поражения слухового нерва, либо односторонней невриномы, сочетающейся с менингиомой или спинальной невриномой или каким-то иным «нейрофиброматозным» симптомом, таким как «кофейные пятна», опухоли периферических нервов, катаракта и гамартома сетчатки.

Выделяют церебральную и спинальную формы заболевания. При церебральной форме нейрофиброматоза клиническая картина определяется опухолевым процессом в полости черепа в виде общемозговых и очаговых симптомов. Опухоли мозга могут сопровождаться повышением внутричерепного давления, в результате которого появляется головная боль, рвота. Очаговая симптоматика зависит от места расположения опухоли и вовлечения в процесс черепно-мозговых нервов.

Спорадические случаи характеризуются более высокой частотой множественных менингиом и спинальных опухолей. Ни одна из этих опухолей не характерна для нейрофиброматоза I типа. Частыми сопутствующими симптомами при нейрофиброматозе второго типа являются односторонняя или билатеральная глухота, развивающаяся вследствие акустических неврином - рис. 84, и реже субкапсулярные/капсулярные катаракты и слепота. У большинства пациентов кофейные пятна и периферические нейрофибромы либо полностью отсутствуют, либо их число не превышает шести. По нашим данным, единичные пятна «кофе с молоком» присутствуют у 14% больных с нейрофиброматозом II типа.

mn_r84.jpg
Рис. 84. Левосторонняя акустическая невринома

Течение нейрофиброматоза II типа у детей характеризуется некоторыми особенностями. Из 334 случаев заболевания в Великобритании в 61 (18%) болезнь была диагностирована в возрасте до 15 лет (Evans et al., 1999). Более чем у 40% из них были симптомы акустической шванномы, у девятнадцати больных детей были менингиомы, у семи - спинальные и у пяти - кожные опухоли.

Таким образом, дети с менингиомами, акустическими и кожными шванномами и нейрофибромами должны проходить тестирование на нейрофиброматоз II типа, особенно если они не удовлетворяют полным диагностическим критериям нейрофиброматоза I типа. По нашим данным, из 79 случаев нейрофиброматоза II типа у 45 пациентов заболевание было диагностировано в возрасте до 15 лет (57%). Диагноз был подтвержден данными компьютерной и магнитно-резонансной томографии головного и спинного мозга (рис. 85).

mn_r85.jpg
Рис. 85. МРТ-исследование головного мозга

Анализ регистра 368 больных с нейрофиброматозом II типа из Великобритании показал, что смертность оказывается выше среди тех пациентов, у которых болезнь диагностируется в более раннем возрасте и особенно при развитии менингиом (Baser et al., 2002). В среднем показатель смертности увеличивается в 1,13 раза при уменьшении на год дебюта заболевания и в 2,5 раза - при наличии менингиом. Относительный риск смертности у пациентов, проходивших лечение в специализированных центрах, составляет 0,34 по сравнению с теми больными, которые лечились в неспециализированных центрах.

Картирование и идентификация гена NF2

Картированию гена NF2 способствовало обнаружение потери полиморфных ДНК-маркеров длинного плеча хромосомы 22 в опухолевых, но не в нормальных тканях акустических неврином, нейрофибром и менингиом пациентов с нейрофиброматозом II типа (Seizinger et al., 1986; Seizinger et al., 1987). При этом одна из точек разрыва делеции, обнаруживаемых в опухолевых тканях пациентов, располагалась дистальнее маркера D22S9, картированного в области 22q11.

В дальнейшем локализация гена NF2 в длинном плече хромосомы 22 в области 22q11.21-q13.1 была подтверждена при генетическом анализе, выполненном в большой семье с нейрофиброматозом II типа (Wertelecki et al., 1988). Целая серия ДНК-зондов была изолирована из области локализации гена NF2. Эти зонды были успешно использованы при проведении досимптоматической и пренатальной диагностики заболевания (Rouleau et al., 1990).

Ген NF2 был одновременно идентифицирован в двух различных лабораториях (Trofatter et al., 1993; Rouleau et al., 1993). Первой группе исследователей удалось выделить ген из области локализации концов микроделеций, обнаруженных у двух пациентов с нейрофиброматозом II типа, а также в опухолевых тканях менингиом двух других неродственных пациентов.

Оказалось, что кандидатный ген кодирует полипептид, названный авторами Мерлином, размером в 587 аминокислот, имеющий большое сходство по аминокислотной последовательности с некоторыми членами семейства белков, участвующих в реализации связи компонентов цитоскелета с мембраной, в частности с эзрином, радиксином и моезином (семейство белков ERM).

Данные этих авторов были убедительно подтверждены исследователями другой группы (Rouleau et al., 1993), которым удалось, используя стратегию позиционного клонирования, идентифицировать четыре гена в районе геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) размером около 1 миллиона пар оснований, фланкированной микросателлитными маркерами (D22S211 и D22S32), наиболее тесно сцепленными с геном NF2.

Оказалось, что два из четырех идентифицированных генов часто вовлечены в хромосомные перестройки, наблюдаемые при саркоме Юинга (EWS), и, по-видимому, ответственны за развитие этого состояния. Третий ген был идентичен картированному ранее в хромосоме 22 нейрональному гену тяжелой цепи нейрофиламент - NEFH. Четвертый ген размером около 100 кб рассматривался авторами как наиболее вероятный кандидат для NF2.

Это предположение нашло подтверждение при дальнейших исследованиях. Оказалось, что изолированная из тканеспецифической библиотеки мозга плода кДНК-овая последовательность этого гена, используемая в качестве зонда для молекулярного анализа ДНК больных, обнаруживает у части пациентов с нейрофиброматозом II типа достаточно протяженные делеции, косегрегирующие в семьях с заболеванием.

Идентифицированный ген, названный авторами SCH, разделен на 16 экзонов. Он экспрессируется во многих тканях, включая почки, легкие, молочные железы, яичники, плаценту, нейробластому, и не экспрессируется в мозге взрослых, в печени и в поджелудочной железе. Наивысший уровень его экспрессии наблюдается в мозге плода. Размер соответствующей мРНК - 4,5 кб. По-видимому, в разных тканях возможен альтернативный сплайсинг гена, так как описаны две его транскрипционные изоформы, кодирующие белки, отличающиеся по С-концу (Bianchi et al., 1994).

Первичный биохимический дефект

При секвенировании кДНК-овой последовательности гена SCH обнаружена открытая рамка считывания размером 1785 нуклеотидов, способная кодировать белок, состоящий из 595 аминокислот. Этот белок с предсказанной молекулярной массой в 66 кД был назван шванномином и, по-видимому, он идентичен мерлину, так как было обнаружено его сходство по аминокислотной последовательности и по вторичной структуре с эзрином, радиксином и моезином.

Таким образом, стало очевидно, что ген SCH также идентичен гену NF2. Белки ERM, и в частности эзрин и моезин, преимущественно локализованы в сократительных волокнах, в пузырьках, в структурах, вовлеченных в прикрепление клеток, в их движение и в эпителиально-мезинхимальные трансформации при развитии.

Гомология по аминокислотной последовательности между мерлином и другими белками ERM составляет 47-48% и достигает 64% в N-концевом участке. В С-конце мерлина найдена последовательность, сходная с повторяющимся транспозоноподобным элементом L1 генома крыс. Мерлин имеет два больших домена: N-терминальный и альфа-спиральный, а также маленький уникальный С-концевой домен.

Третичная структура мерлина сходна со структурой других белков, осуществляющих связь цитоскелета клетки с ее мембраной, хотя мотивов связывания с актином мерлин не имеет. Обнаружена гомология мерлина с тирозинфосфатазой 1 и эритроцитарным белком 4.1 (25% сходства по аминокислотной последовательности для всего белка и 44-46% для N-концевого участка). Эти данные позволяют предполагать, что мерлин локализован на поверхности клетки и действует как мембрано-организующий белок.

По-видимому, его N-терминальный домен способен связываться с интегринами, а альфа-спиральный домен взаимодействует с компонентами цитоскелета, связывая трансмембранные гликопротеины со спектрин-актиновым комплексом. Показано непосредственное взаимодействие мерлина с такими белками, как спектрин, регуляторный факгор Ма+/Н+-обмена, синтенин, эзрин, CD44, р-интегрин. Две изоформы мерлина, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга экзонов 16 и 17, различаются по длине на 15 аминокислот, локализованных на С-конце.

Подобно другим ERM-белкам мерлин-1 способен к меж- и внуримолекулярным ассоциациям по типу «голова-хвост», что очень важно для осуществления белковых взаимодействий. Предполагается, что функции мерлина-2, не имеющего 15 С-концевых аминокислот, связаны с внуримолекулярным скручиванием.


По-видимому, также как талин, мерлин участвует в регуляции цитоплазматического наполнения клетки и организации клеточной поверхности. Эти функции важны для образования устойчивых межклеточных контактов и взаимодействий между клеткой и матриксом. Отсутствие мерлина может приводить к миграции клеток, изменениям на их поверхности или потере контактного ингибирования.

Недавно было показано, что мерлин взаимодействует с адапторным белком паксиллином, участвующим в интеграции адгезивных и митогенных сигналов в изменения (1) организации актинового цитоскелета и (2) генной экспрессии. Это взаимодействие необходимо для правильной мембранной локализации мерлина и его ассоциации с бета-1 -интегрином и с рецептором эпидермального фактора роста - рис. 86 (Fernandez-Valle et al., 2002).

mn_r86.jpg
Рис. 86. Взаимодействие мерлина с паксиллином

В мерлине идентифицированы два паксиллин-связывающих домена (PBD). Один из них - PBD1, локализован между 50-70 аминокислотными остатками в области, кодируемой экзоном 2, другой - PBD2 - между 425 и 450 аминокислотными остатками.

Подобно другим белкам семейства ERM мерлин способен связываться с ERM-взаимодействующим фосфобелком ЕВР-50. С использованием 2-гибридной дрожжевой системы показано, что мерлин взаимодействует с тирозинкиназным субстратом HRS, регулируемым гепатоцитарным фактором роста HGF (Scoles et al., 2000). Область взаимодействия с HRS расположена между 453-557-м аминокислотными остатками мерлина. HRS ассоциирован с эндосомами и может участвовать в переносе рецепторов на лизосомы. В культивируемых клетках Шванна (STS26T) мерлин и HRS локализованы на эндосомах. Не исключено, что мерлин является участником HRS-опосредуемого сигнального пути.

Гиперэкспрессия в культивируемых клетках шванномы крысы мерлина дикого типа ингибирует клеточный рост, приводит к временным нарушениям организации F-актина, распределения и прикрепления клеток, а также к ограничению их передвижения (Gutmann et al., 1999). Этих эффектов не наблюдается при гиперэкспрессии мутантных изоформ мерлина или сплайсинговых вариантов, не имеющих рост-ингибирующей активности.

Таким образом, функция мерлина необходима для поддержания нормальной организации цитоскелета, а его влияние на клеточный рост зависит от специфической реорганизации цитоскелета. Регулируемая гиперэкспрессия HRS в той же клеточной линии приводит к сходным эффектам, включая ингибирование роста, уменьшение подвижности клеток и аномалии в их распределении (Gutmann et al., 2001). По-видимому, супрессия роста клеток осуществляется мерлином, находящимся в связанном с HRS положении, так как гиперэкспрессия его С-терминального участка, не участвующего во взаимодействии с HRS, не оказывает ингибирующего влияния на клеточный рост.

С использованием упоминавшийся выше регулируемой экспрессионной системы был выполнен функциональный анализ восьми миссенс-мутаций в гене NF2 (Gutmann et al., 2001). В результате было показано, что замена аминокислот предположительно в альфа-спиральном районе белка не ухудшает функций мерлина как негативного регулятора роста, в то время как при N- или С-терминальной локализации мутаций эта функция утрачивается. По-видимому, ключевые функциональные домены мерлина лежат в высококонсервативной области гомологии с семейством ERM-белков, а также в уникальном С-терминальном районе.

В опытах in vitro было показано, что при экспрессии в клетках млекопитающих различных мутантных вариантов гена NF2 в 80% случаев значительно меня отся адгезивные свойства клеток, в результате чего происходит их открепление от субстрата (Stokowski, Сох, 2000). Подобные изменения могут быть начальным шагом в патогенезе нейрофиброматоза II.

Мутации в гене NF2

В одном, из первых исследований был проведен планомерный поиск мутаций в шести экзонах гена NF2 у 90 неродственных пациентов с использованием методов амплификации, исследования подвижности образовавшихся фрагментов в условиях денатурирующего градиентного гель-электрофореза и секвенирования аномальных фрагментов (Rouleau et al., 1993).

При этом только у 15 пациентов были идентифицированы мутации. 14 из них приводили к преждевременному прекращению процесса трансляции вследствие образования стоп-кодона, сдвига рамки считывания или нарушения нормального сплайсинга и лишь одна мутация сопровождалась заменой неконсервативной аминокислоты в мерлине. В соответствии с современными представлениями примерно у трети больных присутствуют протяженные делеции в гене NF2.

Скрининг делеции может быть легко осуществлен с использованием 16 идентифицированных полиморфных геномных маркеров NF2-локуса, позволяющих проводить семейный тест на гомозиготность (Legoix et al., 1999). По данным разных авторов, точковые мутации составляют от 34 до 66%. Чаще всего они сопровождаются преждевременным прекращением трансляции, образованием укороченного белка или его отсутствием. К такому же эффекту приводят делеции экзона 2 и рекуррентная миссенс-мутация F62S в том же экзоне.

Напомним, что экзон 2 кодирует участок связывания с паксиллином. Мутации в этой области могут приводить к нарушению мембранных функций мерлина (Fernandez-Valle et al., 2002). По-видимому, экзону 2 принадлежит ключевая роль в контроле клеточного роста. Это подтверждается и в экспериментах, выполненных на мышиной моделе. Избирательное разрушение экзона 2 гена Nf2 в клетках Шванна экспериментальных животных приводит к развитию шванном (Fernandez-Valle et al., 2002). При этом нарушается ассоциация дефектного мерлина с мембраной и наблюдается его диффузная локализация в клетках.

Миссенс-мутации в гене NF2 достаточно редки и ассоциированы с более мягким течением заболевания. Подобные мутации описаны также у пациентов со спорадическими шванномами без клинических признаков нейрофиброматоза. Показано, что мутации L46R, L360P, L535P, Q538P снижают связывание мерлина с фосфобелком ЕВР-50 и с тирозинкиназным субстратом HRS (Stokowski, Сох, 2000; Scoles et al., 2000). Смертность в группе больных с миссенс-мутациями достоверно ниже по сравнению с больными, несущими другие мутации в гене NF2 (Baser et al., 2002).

При молекулярном анализе гена NF2 у больных из 125 семей с классическим нейрофиброматозом II типа и с билатеральными акустическими шванномами мутации были идентифицированы в 52 случаях, причем в 27 из 79 спорадических случаев (34%) и в 25 из 46 семейных случаев (54%) (Evans et al., 1998). Пятеро больных, у которых нейрофиброматоз II был диагностирован в семье впервые, оказались соматическими мозаиками. Только один ребенок из девяти детей от трех родителей-мозаиков оказался болен. Соматический мозаицизм является частой причиной развития классических форм нейрофиброматоза II.

По-видимому, этим может объясняться относительно низкая выявляемость мутаций в спорадических случаях заболевания по сравнению с семейными. Аналогичные результаты были получены в других работах. Так, при обследовании 107 больных с нейрофиброматозом II мутации были диагностированы в 81% семейных и в 51% спорадических вариантов, причем в последнем случае достоверно чаще у пациентов с тяжелым течением заболевания (Kluwe, Mautner, 1998).

Шесть пациентов оказались мозаиками. В итальянских семьях с нейрофиброматозом II также были найдены пациенты, у которых инактивирующие мутации в гене NF2 были обнаружены лишь в части лимфоцитов (Sestini et al., 2000). Примечательно, что у одного из этих пациентов была классическая форма заболевания, в то время как у другого никаких клинических проявлений нейрофиброматоза не было найдено.

Супрессорная роль гена NF2

При молекулярном анализе ДНК, изолированной из тканей 40 кожных опухолей (36 шванном и 4 нейрофибром), развившихся у 20 пациентов с нейрофиброматозом II типа, потеря гетерозиготности в области локализации гена NF2 была обнаружена в 18 случаях (45%) и в пяти опухолях (13%) были обнаружены гомозиготные компаунд мутации в гене NF2 (Kluwe et al., 2000). Таким образом, функциональная инактивация мерлина является критическим шагом в образовании кожных шванном, а ген NF2, также как и ген NF1, относится к классу супрессоров опухолей.

Потеря и/или аберрантное состояние локуса NF2 является важным элементом развития не связанных с нейрофиброматозом II спорадических шванном и менингиом, которые вместе составляют около 30% всех первичных опухолей мозга. Более того, при исследовании упоминавшихся выше шести экзонов гена NF2 в образцах ДНК, изолированных из тканей 30 спорадических шванном и 30 менингиом, не связанных с нейрофиброматозом, также были идентифицированы две нонсенс-мутации и две микроделеций со сдвигом рамки считывания (Rouleau et al., 1993).

Одновременно в этих опухолях наблюдали потерю гетерозиготности по маркерам хромосомы 22, что свидетельствует о полной функциональной инактивации гена NF2. Потеря гетерозиготности по полиморфным маркерам, фланкирующим ген NF2 на хромосоме 22, наблюдается в 60% первичных спорадических менингиом (102/170).

При целенаправленном поиске мутаций в восьми экзонах гена NF2 в опухолевых тканях 151 менингиом идентифицированы 24 мутантных аллеля, полностью инактивирующие функцию гена (Ruttledge et al., 1994). Среди них были нонсенс-мутации, небольшие делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, и сплайсинговые мутации. Ни одной миссенс-мутации не было найдено. Во всех этих случаях наблюдали одновременную утрату гомологичного аллеля в результате соматической делеции фрагментов хромосомы 22.

Делеции хромосомы 22 часто находят в опухолях, частота которых не повышена при нейрофиброматозе II, таких как глиомы, феохромоцитомы, карциномы кишечника и молочной железы. При прямом молекулярном анализе соматические мутации в гене NF2 были найдены во множестве типов опухолей, включая меланомы и карциномы груди (Bianchi et al., 1994). По-видимому, продукт гена NF2 выступает как супрессор опухолей не только в определенных клетках нервной системы, но и во многих других тканях.

В опытах in vitro получены прямые доказательства супрессорной роли мерлина. Так, ретровирусный перенос гена NF2 в первичные культуры клеток шванном пациентов с нейрофиброматозом II типа приводит к значительному снижению пролиферации, остановке клеточного цикла на стадии G0/G1 и индукции апоптоза (Schulze et al., 2002).

Интересно, что у мышей, гемизиготных по Nf2, развиваются не шванномы, а остеосаркомы. Как и в случае шванном у больных с нейрофиброматозом II, в остеосаркомах мышей часто наблюдается инактивация нормального аллеля гена. По-видимому, в клетках Шванна мышей, гемизиготных по Nf2, недостаточна скорость инактивации второго аллеля и потому шванномы не успевают развиться (Giovannini et al., 2000).

В.Н. Горбунова, Е.Н. Имянитов, Т.А. Ледащева, Д.Е. Мацко, Б.М. Никифоров
Похожие статьи
показать еще
 
Категории