Высокоэффективная жидкостная хроматография. Растворители

04 Января в 11:59 1614 0


Растворители. Растворители должны быть очищены от механических примесей. Примеси вызывают плохую работу клапанов, способствуют износу плунжеров и уплотнений, забивают входные фильтры колонок. Поэтому растворители нужно фильтровать через материал с порами 0,5 мкм, при отборе растворителя из резервуара тоже нужен фильтр. Если температура кипения растворителя низкая (ниже 60 °С) - ацетон, метиленхлорид, пентан, эфир и т.д., то при всасывании могут образоваться паровые пузыри, препятствующие работе клапанов. У менее летучих растворителей больше вязкость, что ведет к увеличению сопротивления колонки и к повышению давления на входе при сохранении расхода. Вязкость более 1,5 сП не желательна.

В зависимости от метода детектирования, к растворителям предъявляются определенные требования (табл. 6.2). При УФ, работающем при 190-220 нм, применимы вода, ацетонитрил, метанол, этанол, гексан, гептан, циклогексан и т.д. Поглощают обычно примеси, поэтому надо использовать не ХЧ, а «для ЖХ» или «для спектроскопии».

Таблица 6.2. Элюотропный ряд - перечень растворителей в порядке возрастания элюирующей способности
 Элюотропный ряд - перечень растворителей в порядке возрастания элюирующей способности

Перечень наиболее часто используемых растворителей:
- Вода (лучше бидистиллят, еще лучше деионизованная и очищенная от органики).
- Спирты (метанол, этанол, изопропанол) - годятся и ХЧ. Для обращено-фазовой хроматографии лучше использовать метанол - у него меньше всего вязкость (0,54 сп), для НФ- изопропанол, неограниченно смешивающийся с углеводородами.
- Ацетонитрил - удобен для ОФХ (низкая вязкость 0,34 сп) и хорошая растворимость.
- Ароматика - поглощает в УФ и токсична.
- Алканы - гексан в НФ (недостаточно растворяет).

Специфические модификаторы ПФ вводятся для изменения свойств сорбента в лучшую сторону, улучшения разделения. Уксусная кислота 0,5-2,0 % - используется для аммоний -ацетатных буферных растворов, поглощает ниже 230 нм. Фосфорная кислота- в ОФХ д ля буферных растворов или для создания кислой среды. Аммиак- буферы в ОФХ и ИОХ. Алкилсульфаты натрия (от С2 до С12-) добавки для перевода в ион -парный режим, рН 2-5. Величина удерживания оснований растет. Тетра и триалкиламмоний - ион -парный вариант определения кислот (с ростом концентрации ТБА растет удерживание анионов). Аммиа-к буферы в ОФХ и ИОХ. Алкилсульфаты натрия (от С2 до С12)- добавки для перевода в ион -парный режим, рН 2-5.

Выбор условий разделения. Распределение молекул сорбатов между неподвижной и подвижной фазами определяется, в первую очередь, сравнительным сродством этих молекул к полярным или неполярным растворителям (или поверхностям). Это сродство является главным фактором, влияющим на величины удерживания, выбор неподвижной и подвижной фаз.

Так, при использовании неполярных НФ (обращенно-фазная хроматография) удерживание ряда сорбатов уменьшается с увеличением их полярности, а удерживание данного сорбата на данной НФ уменьшается с уменьшением полярности ПФ, т.е. при добавлении органических растворителей. В противоположность этому, при хроматографии на полярных сорбентах (нормально-фазная хроматография) удерживание растет с ростом полярности сорбатов и уменьшением полярности ПФ. То есть «подобное притягивается подобным».

Ряд правил, которые надо помнить при выборе условий разделения:
1. Адсорбционная хроматографическая система обладает удерживающей способностью только в тех случаях, когда условная полярность ПФ и НФ различается в достаточной степени. Величины удерживания тем больше, чем больше разница в полярности, химической природе фаз.

2. Приемлемые величины удерживания достигаемы только в таких случаях, когда полярность сорбата является промежуточной по сравнению с полярностью ПФ и НФ. Поэтому основной способ влияния на удерживание на данном сорбенте - изменение полярности подвижной фазы.



3. При хроматографии на силикагеле удваивание концентрации полярного компонента в ПФ ведет к уменьшению удерживания в 2,0-2,5 раза. При хроматографии на алкилсиликагелях (С2, С8, С18) уменьшение концентрации растворителя в 1, 2 раза приводит к 2,0-2,5 кратному уменьшению удерживания сильно сорбирующихся веществ (К' > 10) и 1,2-1,5 кратному уменьшению для слабо сорбирующихся (К' < 2).

4. При хроматографии ионогенных соединений, если рН среды такое, что допускается одновременное существование сорбата в нейтральной и ионизированных формах, степень ионизации в сорбированном и десорбированном состоянии различна. Следствие- снижение эффективности разделения, нарушение формы пика. Поэтому надо использовать ПФ на основе буферных растворов. Без этого трудно добиваться воспроизводимости и качественного разделения. В общем с понижением рН TR оснований падет, а кислот растет.

Выбор хроматографической системы. Под термином «тип хроматографической системы» понимают сочетание: сорбента того или иного химического класса, подвижной фазы на основании водных или органических растворителей, характеризующейся интервалом рН, наличием специфических добавок кислого, основного или поверхностно-активного характера и т.д.

Выбор типа системы основывается в первую очередь по оценке полярности и кислотно-основных свойств компонентов изучаемой системы. Условная оценка полярности анализируемых веществ, понимаемой в данном случае как относительное количество полярных и неполярных структурных фрагментов, представленных в их молекулах, может быть основана на шкале упрощенного критерия гидрофобности Н. Этот критерий рассчитывается по формуле
Условная оценка полярности анализируемых веществ, (6.30)
где nH - суммарное число атомов углерода и галогенов; nf - число функциональных групп в молекуле сорбата.

Чем больше Н, тем меньше полярность, выше гидрофобность (водоотталкивание). При хроматографии неполярных сорбатов средней полярности очень часто оказываются пригодными как нормально-, так и обращеннофазные системы.

Для сорбатов с низкой (ароматика) или высокой (органические кислоты, спирты) полярностью пригодны ОФХ. Силикагель (НФХ) селективнее при разделении изомеров (о, м, п), а также сорбатов, различающихся по функциональности (производные бензола, фенола и т.д.). При разделении гомологов (пентан- декан), спиртов , кислот лучше применять алкилсиликагели (ОФХ). Если в анализируемой смеси предполагаются компоненты разной химической природы: витамины, лекарства, наркотики, токсины, гормоны начинать разработку метода лучше с ОФХ.

Выбор элюирующей силы и селективности подвижной фазы При работе в ОФХ выбор элюирующей силы сводится к выбору концентрации органического компонента подвижной фазы. В первичном случае может быть использован подход на зависимости удерживания от Н. Если известны принадлежность сорбата к определенному классу веществ и модель удерживания этого класса в ОФХ, то задача упрощается.

Для такого расчета концентрации элюента есть уравнение:
Для такого расчета концентрации элюента есть уравнение(6.31)
где К' - коэффициент емкости при концентрации растворителя С, Сх - концентрация растворителя, необходимая для получения желаемого К'х.

В НФХ для наименее полярных фаз (15 > H > 10) используют гексан:ИПС (95:5) или гексан:хлороформ (1:1). Для среднеполярных (10 > H > 5) - гексан-ИПС (80:20) или хлороформ:метанол (95:5). Для полярных (5 > H > 0) - хлороформ:метанол (80:20).

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы