Высокоэффективная жидкостная хроматография. Колонки, детекторы

04 Января в 11:55 1335 0


Успех ВЭЖХ обусловлен не только созданием сорбентов, но и колонок, учитывающих особенности процесса разделения в ЖХ. Наиболее важны 2 момента: 1) создание максимально однородного слоя сорбента в цилиндрической трубке; 2) сведение к минимуму мертвых объемов в колонке и соединительных трубках.

Аналитическая колонка представляет собой трубку из нержавеющей стали, титана или стекла, заполненную сорбентом и закрытую с обеих сторон фильтрами для предотвращения высыпания сорбента. Фильтры имеют диаметр пор 2-5 мкм, что не создает сопротивления потоку.

Для получения высокой эффективности колонок необходимо соблюдение некоторых условий:
1. Внутренняя поверхность колонки должна быть зеркально гладкой;
2. Сорбент должен иметь однородную фракцию (5 + 1 мкм);
3. Переход от большого диаметра колонки к малому диаметру штуцера должен быть плавный, т.е. нужна конусная выточка в корпусе штуцера.
4. Стенка колонки должна быть достаточно прочной, чтобы выдержать давление 300-500 атм.
5. Между торцом колонки и фильтром не должно быть мертвого объема (воздушного зазора), что очень трудно обеспечить в соединениях типа «свагелок».

Учитывая уникальные свойства сорбентов, сложную конструкцию колонок, тщательность набивки колонок и их тестирование, стоимость колонок составляет 1 000-1500 дол. США (отечественные колонки 1 млн руб.). Поэтому крайне желательно беречь колонки, предохранять от загрязнений с помощью предколонок, заполненных тем же сорбентом, но длиной 30-70 мм.

Чтобы колонка не «садилась», необходимо производить набивку колонки при давлении в 3-4 раза выше ее рабочего давления (т.е. 300-400 кгс/см ). Для хорошей колонки N = 30 000-100 000 т.т./м.

Детекторы. Детектор является преобразователем концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал.

В современном жидкостном хроматографе для детектирования компонентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство подвижной фазы (поглощение света, излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений (табл. 6.1). Из существующих 50 физико-химических методов детектирования в настоящее время активно используется 5-6.

Таблица 6.1. Основные типы детекторов, используемые в ВЭЖК
Основные типы детекторов, используемые в ВЭЖК

Наибольшей сложностью при конструировании хроматографических детекторов было сочетание малых объемов ячеек (0,1-10 мкл, менее 10 % от объема неудерживаемого пика) с высокой чувствительностью (ввиду малого объема и низкой концентрации пробы). Иллюстрацией достигнутых успехов является то, что чувствительность фотоколориметров и спектрофотометров составляет 10-2 ед. оптической плотности, в то время как чувствительность фотометрических детекторов - 10-5 ед. оптической плотности, т.е. в 1 000 раз выше.

Чувствительность - это важнейшая характеристика детектора. Лучше всего оценивать этот параметр по физической величине. Если определять чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, шум выражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического детектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактометрического - в единицах показателя преломления, вольт-амперометрического -в амперах, кондуктометрического - в сименсах. Для химика, очевидно, интереснее определять чувствительность в минимальном количестве определяемого вещества.

Чувствительность детектора может быть примерно одинаковой ко всем компонентам пробы (рефрактометр и кондуктометр), а может быть совершенно разной даже для близких соединений. В первом случае говорят о неселективном детектировании. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее и пробе и растворителю (показатель преломления, электропроводность), их разность.

Во втором случае - селективное детектирование. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее только молекулам пробы, например, способность флуоресцировать или поглощать свет. Селективное детектирование, с одной стороны, позволяет повысить чувствительность определения или исключить те вещества, которые определять не нужно (предельные углеводороды при определении ароматики), с другой стороны, допускает возможность не обнаружить нужных нам компонентов (тех же предельных углеводородов в нефти). Поэтому при исследовании общего состава объекта лучше использовать неселективный детектор типа рефрактометра, а при определении концентрации отдельных компонентов в сложной смеси - селективные детекторы.



Подвижные фазы (ПФ). Элюирующая сила и эффективность Подвижная фаза в ЖХ выполняет двоякую функцию: с одной стороны, она обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке. Для этого химические свойства подвижной фазы не играют существенной роли, более важны их физические свойства: вязкость, летучесть. С другой стороны, подвижная фаза в ЖХ играет активную химическую, по существу, роль.

Молекулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами системы: молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Поэтому вторая и более важная функция подвижной фазы сводится к регулированию констант равновесия, к регулированию удерживания. Возможности регулирования удерживания с помощью подвижной фазы необычайно велики. Нередко заменой одного растворителя на другой, можно изменить коэффициент емкости К' в 1 000-10 000 раз, однако для практической хроматографии пригоден лишь довольно узкий диапазон величин значение К' - примерно 1-20.

Слишком малые значения К' непригодны, т.к. в этой области резко возрастает вероятность взаимного перекрытия пиков. Наоборот, если К' слишком велико, для разделения требуется слишком много времени, к тому же увеличивается риск не обнаружить более прочно сорбирующиеся компоненты смеси.

Таким образом, для решения каждой конкретной задачи состав как подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран по физическим и химическим свойствам ее компонентов. Основными характеристиками подвижных фаз являются их элюирующая сила и селективность.

Один из элюентов способен смыть с колонки лишь слабосвязанные сорбаты, другие же вызывают десорбцию почти любых молекул. Молекулы подвижной фазы могут взаимодействовать с молекулами разделяемых веществ. При этом образуются ассоциаты, которые взаимодействуют с неподвижной фазой, сила этого взаимодействия отличается от силы взаимодействия молекул пробы. В результате сорбция может стать более или менее прочной. С другой стороны, молекулы подвижной фазы могут конкурировать на поверхности сорбента с молекулами разделяемых соединений, вытесняя последние с активных центров и способствуя смещению равновесия в сторону десорбции. Для характеристики влияния подвижной фазы на удерживание используют понятие элюирующей силы.

Элюирующая сила подвижной фазы - это ее свойство вступать в такие межмолекулярные взаимодействия с компонентами системы, которые способствуют десорбции разделяемых соединений, более быстрому перемещению хроматографических зон.

Один подходящий растворитель подобрать трудно. Зато смесь растворителей очень увеличивает гибкость ВЭЖХ. Принцип составления таких смесей прост. Необходимо взять два индивидуальных растворителя, один из которых имеет заведомо недостаточную элюирующую силу (А1, А2), другой заведомо избыточную (В1). Из этих двух растворителей можно приготовить множество различных подвижных фаз. Часть из них будет обязательно обладать подходящей элюирующей силой (А2, В1). Сила растворителя является экспериментально определяемым интегральным параметром. Когда мы говорили, что растворитель имеет подходящую силу, под этим имеется ввиду, что на данном сорбенте данный сорбат будет иметь приемлемое значение К'.

В то же время ясно, что для разделения уже двух соединений подойдет не любая из подвижных фаз, имеющих необходимую силу. Вещества могут иметь хорошее удерживание, но часть пиков перекрывается. В таких случаях мы говорим, что селективность системы недостаточна. Селективность определяется селективностью подвижной фазы, что связано со специфическими взаимодействиями с сорбатами.

Селективность, как и элюирующая сила бинарной подвижной фазы, определяется в первую очередь природой более сильного ее компонента. В составе почти любой ПФ можно найти компонент сорбционно менее активный, выполняющий преимущественно транспортную функцию (растворитель А), и сорбционно активный, который служит для регулирования равновесия (растворитель В). Роль одного и того же компонента в различных подвижных фазах и в зависимости от характера НФ, может быть различной.

Например, в ПФ гексан-хлороформ последнее соединение выступает в качестве растворителя В (активного), а в системе хлороформ метанол оно же играет роль растворителя А (транспортного). С целью повышения селективности часто используют подвижные фазы более сложного состава, чем бинарные. Во многих случаях это приводит к улучшению разделения.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы