Условия культивирования тканей. Стерилизация питательных сред

28 Декабря в 18:51 2940 0


Богатая питательная среда - прекрасный субстрат для развития в ней микроорганизмов. Для обеззараживания питательных сред используют химическое воздействие (дезинфекция), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук, ультрафиолетовые лучи, ультрафильтрация). Каждый из этих методов весьма избирателен для применения.

В биотехнологии широко используют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.)

Как известно, отдельные компоненты питательных сред также по-разному реагируют на термическое воздействие. Особенно термолабильны органические соединения: витамины, углеводы, гормоны и др. Сложные сахара и полисахариды при автоклавировании частично гидролизуются. Степень гидролиза зависит от источника углерода, температуры и продолжительности автоклавирования. При высоких температурах происходит карамелизация сахаров.

Растворы, содержащие аминокислоты и восстанавливающие сахара, при термическом воздействии приобретают коричневатый цвет вследствие сахароаминных реакций.

Все эти процессы сильно зависят от рН используемой среды. Существует сложная зависимость между рН среды, содержанием ионов, температурой, продолжительностью автоклавирования, с одной стороны, и степенью термодеградации питательных сред - с другой.

Во избежание нежелательных деструктивных изменений компонентов питательных сред (субстратов) применяют по возможности более мягкие режимы стерилизации (табл. 4.4) или раздельную стерилизацию компонентов. Высокие, но кратковременные температурные режимы инактивируют споры бактерий, оказывая минимальное влияние на биологически активные компоненты среды. В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и некоторых других объектов проводят в автоклавах паром под давлением, соблюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации.

Таблица 4.4. Режимы стерилизации питательных сред
Режимы стерилизации питательных сред

Установлено, однако, что температура выше 121 С может быть причиной нарушения качества сред и, как следствие, плохого роста культур. К тому же в принципе желательна стерилизация автоклавированием небольших объемов питательных сред, что при прочих равных условиях позволяет уменьшать время стерилизации, так как укорачивается период прогрева проб (табл. 4.5).

Таблица 4.5. Рекомендуемые интервалы стерилизации разных объемов сред (t = 121 С)
Рекомендуемые интервалы стерилизации разных объемов сред

В последнее десятилетие широкое распространение для получения стерильных воздуха и различных жидкостей приобрела мембранная фильтрация. Это разновидность холодной стерилизации, которая эффективна для стерилизации термолабильных веществ.

Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с конца 40-х гг. прошлого столетия. Согласно Р.Е. Кестингу (1971), наиболее распространенными процессами являются обычная фильтрация (макрофильтрация -1-10   мкм), микрофильтрация (20 -10 мкм), ультрафильтрация, диализ (10 мкм-1 нм).



Если для макрофильтрации применяются обычные бумажные или стеклянные фильтры, то для остальных используются нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливинильные, полиамидные, фторуглеродные мембраны толщиной менее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в пределах 10-4-10 мкм. Для стерилизации в биотехнологических целях достаточно микрофильтрации.

Основные требования к условиям культивирования

Все манипуляции с культурой изолированных тканей растений проводятся в стерильных условиях. Комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости - и конечного продукта.

Асептика предусматривает влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер - от франц. barbotage - перемешивание) и пр.

К механической защите относятся удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов; герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической - обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической - обработка рабочих поверхностей и биообъектов химическими антисептиками.

В производственных условиях источниками микробов-контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, из которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства

Культивирование изолированных тканей растений происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры 1 000-10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.

Влажность в световой комнате должна быть 60-70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, особенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей -25-26 °С, для культуры тканей тропических растений - 29-30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18-20 °С.

Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается гетеротрофно.

Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, например, как ткань мандрагоры. Каллусные ткани получают в темноте или при рассеянном свете, а для успешного морфогенеза их переносят в помещения с интенсивным освещением 1 000-4 000 лк.

Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы