Трансгенные растения и животные как биореакторы

26 Декабря в 11:01 5226 0


Задачей селекционеров во все времена было получение хозяйственно ценных растений, животных, микроорганизмов. Основными методами традиционной селекции являются отбор, гибридизация, мутагенез, полиплоидия с целью получения нужного признака, который кодируется новым геном или новым комплексом генов.

Существенное продвижение в понимании того, как функционируют гены, расшифровка геномов и развитие методологии генной инженерии позволили перейти от длительных и трудоемких методов традиционной селекции к прямому генетическому конструированию нужных признаков у конкретного организма. При создании трансгенного организма новый генный комплекс конструируется в пробирке и напрямую вводится в организм, фактически таким методом получения нового признака ученые просто ускоряют эволюцию.

Новые методы селекции - это сочетание молекулярных и традиционных методов. Необходимо отметить, что старые методы также остаются широко востребованными при создании новых организмов. Выяснилось, что трансформированные с идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена, поскольку работает эффект положения и копийности гена.

И необходимо проводить дальнейший отбор с анализом наследования полученного признака, используя традиционные методы селекции. Генно-инженерные манипуляции с геномом, сформировавшимся в процессе длительной эволюции, могут нарушать, в какой-то степени, сбалансированные генные комплексы и, соответственно, жизнеспособность полученных трансгенных организмов.

Например, встраивание селективного гена, нужного только для отбора трансгенных растений, может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.

Появляется необходимость дальнейшего скрещивания и отбора для удаления нежелательных побочных мутаций у трансгенов. Иногда имеется необходимость удаления маркерных генов вообще, так что для получения новых организмов применяется сочетание старых и новых методов селекции.

В настоящее время практическая генно-инженерная биотехнология развивается по двум основным направлениям.

Первое направление, получившее не очень удачное название «молекулярное разведение (или селекция)» (molecular breeding), специализируется на решении новыми методами традиционных селекционно-генетических проблем повышения продуктивности хозяйственно ценных организмов и их защиты от различных биотических и абиотических стрессовых факторов. Второе направление, названное «молекулярным производством»» (molecular farming), специализируется на получении и использовании трансгенных организмов в качестве биореакторов, продуцирующих ценные для промышленности и медицины органические соединения.

Конструирование трансгенных растений

Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентности их некоторых клеток, т.е. способности в определенных условиях под действием фитогормонов дифференцироваться с образованием полноценного растения. Таким образом, из сконструированных генно-инженерными методами отдельных клеток можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный генный комплекс (трансгенные растения).

Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Кроме того, многие растения легко размножаются вегетативно. Существующими приемами микроклонального размножения in vitro из микроскопических кусочков ткани (эксплантов) можно быстро получить за короткий промежуток времени генетически однородный посадочный материал с высоким коэффициентом размножения, что важно для последующего применения трансгенного организма.

Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов, отделить от нетрансформированных клеток и получить из отдельных клеток целые трансгенные растения (рис. 2.12). К настоящему времени для трансформации растений разработано несколько эффективных систем переноса рекомбинантной ДНК в клетки и экспрессирующих векторов, которые работают в ряде растительных клеток.
Векторы на основе Ti-плазмид.

Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов (кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли)
Рис. 2.12. Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов (кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли)

Бактерии рода Agrobacterium иногда называют природными генными инженерами за их способность переносить свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных растений корончатых галлов - трансформация индуцирует образование опухолей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200-250 тнп (рис. 2.13), которая содержит все гены, необходимые для инфекционного процесса.

Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие последовательности Т-ДНК
Рис. 2.13. Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие
последовательности Т-ДНК


После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК (transferred DNA), 12-24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного конъюгации. При этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя от деградации.

Все белки содержат сигнал ядерной локализации (NLS), который обеспечивает перенос Т-комплекса из цитоплазмы в ядро растительной клетки. Введенные гены Agrobacterium активируются в растении, программируя разрастание ткани (формируется галл), которая начинает синтезировать и секретировать опины. Опины - продукты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров Agrobacterium -используют как источник углерода и азота, причем другие исследованные почвенные микроорганизмы не способны использовать данные соединения. Таким образом, Agrobacterium генетически трансформирует растительные клетки в «биологические фабрики» по производству для себя «продуктов питания».

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из переносимой Т-области, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами.

Вместо онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки генетической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий, несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью, но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинарных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют пару из двух элементов для полноценного функционирования системы переноса генов в растительную клетку с помощью агробактерий.



Генетически модифицированные растения получают простой инкубацией любых частей растения с суспензией рекомбинантных агробактерий. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов (эухроматин).

Для внедрения больших фрагментов ДНК в клетки растений путем введения фланкирующих Т-область последовательностей из Ti-плазмиды в состав векторов для клонирования больших фрагментов ДНК получены соответствующие космидные векторы, а также векторы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС), получившие название TAC (transformation-competent bacterial artificial chromosomes). ТАС-векторы могут быть реплицированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что позволяет с помощью рекомбинантных агробактерий вводить в клетки растений фрагменты ДНК длиной более 150 тнп.

Другие векторы для конструирования трансгенных растений c прямым введением чужеродных генов в виде очищенной ДНК в растительные клетки также разработаны, поскольку эффективные системы переноса генов в растительный геном с помощью агробактерий работают не для всех видов растений. Эти векторы в основном предназначены для сборки эффективной экспрессионной генной конструкции в E. coli с последующим введением в растительную в клетку очищенной ДНК. Наиболее известные способы доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1.Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки
Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки

Растительные векторы отличаются главным образом различными сигнальными и регуляторными последовательностями, которые обеспечивают эффективную транскрипцию генов в растительных тканях, и различными селективными маркерами. Наиболее важными из регуляторных последовательностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на З'-конце мРНК.

Среди эукариотических организмов эти конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот.

Но для обеспечения достаточного уровня работы чужеродного гена необходимы сильные регуляторные и сигнальные элементы экспрессии, в которых ключевыми являются промоторы, хорошо работающие именно в клетке-мишени. Как и в других системах, для конструирования растительных векторов популярны элементы экспрессионной системы вирусов.

В настоящее время одним из наиболее широко используемых промоторов для двудольных является сильный конститутивный 35S-промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК, CaMV) из группы каулимовирусов. Также для двудольных широко используется nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий, хотя он намного слабее 35S; для однодольных - промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act).

Во многих векторах для трансформации растений как селективный, так и целевой гены находятся под контролем все того же классического 35Б-промотора. Наличие рядом двух копий 35S-промотора может отрицательно сказываться на уровне экспрессии, поскольку множественные копии этого вирусного промотора в геноме могут быть одной из причин «замолкания» трансгена (явление сайлесинга (gene silencing) в ряду поколений). В этой связи в настоящее время ведется как поиск новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм.

Особенно нужны эффективные тканеспецифичные и индуцибельные промоторы для тканеспецифичной и/или индуцированной экспрессии трансгена. Экспрессия под сильными конститутивными промоторами, с одной стороны, приводит к большому количеству целевого белка, с другой - к синтезу этого белка во всех тканях растения, что может отрицательно сказаться на жизнеспособности и стабильности трансгенного растения и часто нежелательно для исследователей.

Векторы для трансформации хлоропластов высших растений (транспластомные векторы) относятся к интегративным векторам. Хлоропласты содержат полноценную генетическую систему, сходную с прокариотическими, т.е. все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации, включая белоксинтезирующий аппарат. Геном хлоропластов (пластом) размером 130-160 тнп заключает в себе более 100 различных генов. Векторы для трансформации хлоропластов предназначены для интеграции чужеродной ДНК в пластом с помощью гомологичной рекомбинации.

Представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие кроме обычного векторного набора два участка длиной по 1 -2 тнп, гомологичные последовательностям ДНК хлоропластов, в которую и происходит встраивание. Экспрессионная кассета между этими гомологичными последовательностями состоит из 5'-некодирующей области с промотором, регулирующим транскрипцию (иногда включает последовательность лидерного пептида перед множественным клонирующим сайтом для целевой ДНК) и 3'-некодирующей регулятор-ной области с терминатором транскрипции, стабилизирующей структуру мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрессии трансгена в хлоропластах.

Для получения эффективной транскрипции клонированного гена часто используют сильный Prrn-промотор оперона рибосомальных рРНК (rrn). В зависимости от размера хлопластной ДНК растения данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов фрагменты ДНК длиной до 50 тнп, содержащие до 20-30 генов. В геноме хлоропластов описано, по крайней мере, около 20 сайтов, по которым удалось получить продуктивную интеграцию вектора.

Получение транспластомных растений, содержащих генетически измененные хлоропласты, является одним из перспективных направлений, поскольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, а значит, устраняется опасность распространения трансгенов с пыльцой среди перекрестно опыляемых растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений менее токсична для насекомых, которые не являются мишенью ее токсического воздействия у растений, синтезирующих инсектициды.

Для генома хлоропластов характерен высокий уровень полиплоидии -10-100 копий на хлоропласт. Учитывая большое число самих хлоропластов на клетку, каждая отдельная клетка с трансформированными хлоропластами содержит тысячи копий трансгена, что позволяет получать очень высокий уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков (до 25 % от суммарного растворимого клеточного белка).

Транзиентная «временная» экспрессия в растениях - это еще один путь для синтеза чужеродных целевых белков. Преимущество транзиентной экспрессии заключается в том, что этот метод не приводит к возникновению трансгенного растения с его экологическими и другими ограничения для ГМО. Чаще всего для этого используются векторы на основе различных фитовирусов, например, вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса мозаики коровьего гороха (ВМКГ).

Заражение растительных тканей производят рекомбинантными вирусами, несущими в своем составе гены целевых белков. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счет чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме зараженных клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений. Иногда такую технологию применяют для масштабного коммерческого производства.

Для транзиентной продукции в растениях также используют векторы Ti-системы. При инфицировании целого растения или его части (листья) рекомбинантной Agrobacterium, содержащей целевой ген в составе бинарного вектора, уровень продукции чужеродного белка может достигать 10-30 % от общего растворимого белка растения в короткое время (5-10 дней). Такой способ также используется, когда требуется проверить сконструированную экспрессионную кассету перед получением стабильных трансформантов или разово наработать небольшое количество (порядка миллиграмма) рекомбинантного белка, например, для оценки его качества или доклинических испытаний.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы