Проблемы экспрессии чужеродных генов. Выделение генетически модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов

26 Декабря в 10:47 2951 0


Проблемы экспрессии чужеродных генов

Чем обусловлено такое разнообразие клонирующих векторов и организмов-хозяев, используемых для получения биотехнологической продукции? Основная задача гетерологичной экспрессии в биотехнологии - получение в больших количествах функционально активного белка в природной конформации с корректными посттрансляционными модификациями.

Еще одним условием биотехнологического производства считается минимизация затрат на единицу продукции. Чем проще организм, тем проще и дешевле культивирование его клеток. Самым простым вариантом экспрессии является бактериальная экспрессия, но в прокариотических организмах невозможны многие посттрансляционные модификации.

Кроме того, часто невозможно обеспечить правильное сворачивание (правильный фолдинг) многих эукариотических белков. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансляционных модификаций.

1. Образование дисульфидных связей. Эту реакцию катализирует фермент дисульфидизомераза. Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным.

2. Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционально активного белка.

3. Гликозилирование - основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, а в некоторых случаях - особые свойства. Наиболее распространенная реакция гликолизирования - это присоединение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину (О-гликозилирование), либо к аспарагину (N-гликолизирование).

4. Модификации аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирование, миристилирование, пальмитоилирование и др.

Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых могут осуществлять часть или все посттрансляционные модификации синтезируемых рекомбинантных белков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков по сравнению с прокариотическими клетками.

В настоящее время не существует единого алгоритма получения рекомбинантного функционально активного белка в больших количествах. Имеются только самые общие рекомендации по выбору экспрессионной системы в зависимости от размеров, структуры белка, его свойств и наличия у него посттрансляционных модификаций. Общей практикой является эмпирический подбор экспрессионной системы для каждого конкретного белка, когда пробуются все имеющиеся в распоряжении исследователя экспрессионные системы от E. coli до клеток млекопитающих (в случае сложных белков).

Уровень экспрессии чужеродного гена также зависит от конструкции экспрессионной кассеты вектора. Коммерческие векторы обычно содержат в составе экспрессионной кассеты весь необходимый набор регуляторных элементов для высокоэффективной генной экспрессии в конкретной клетке-мишени (или универсальные элементы для нескольких хозяев). Регуляторные элементы чужеродного гена, если таковые у него имеются, должны хорошо работать в клетке-хозяине.

Помимо этого, для лучшей экспрессии гена на уровне трансляции мРНК желательно приблизить набор кодонов к типичному для клетки-хозяина. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют «редкие» кодоны на синонимичные «частые», что не сказывается на первичной структуре белка. В результате экспрессия гена в различных системах может быть усилена до 300 раз.

Иногда в структурной части генов могут присутствовать какие-либо нежелательные сигнальные последовательности, например, узнаваемые на уровне мРНК ферментами сплайсинга или деградации в случае эукариотической экспрессии, или терминаторы транскрипции для прокариотической экспрессии, сигналы, узнаваемые ферментами модификации на уровне белка. Наличие таких скрытых («криптических») сигналов ведет к резкому снижению экспрессии гена в клетке-хозяине, поэтому их обычно удаляют также путем точечных замен оснований.

Выделение генетически модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов

Поскольку эффективность введения рекомбинантной ДНК в клетку никогда не бывает 100 %, а эффективность получения стабильных трансгенных клеток вообще очень мала, всегда используются различные методы селекции для выделения трансформированных клеток. В состав рекомбинантных генетических конструкций вводят специальные гены селекции, например, гены устойчивости к антибиотикам и/или репортерные (маркерные) гены, кодирующие какой-либо легко идентифицируемый признак (окраска клеток генами флуоресцентных белков).



При низкой эффективности трансфекции очень удобно использовать гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам и другим веществам, а также различные гены метаболизма, придающие только трансформированным клеткам способность расти на селективной среде. Если эффективность трансфекции достаточно высока, можно проводить отбор полученных трансформантов с помощью прямого анализа ДНК (например, методом ПЦР) и в этом случае можно обойтись без генов селекции. Часто репортерный ген необходим наряду с селективным геном, по которому идет отбор трансформантов, для оценки уровня экспрессии целевого гена.

Полученные в одном эксперименте трансгенные организмы могут сильно различаться по уровню экспрессии чужеродного гена, вследствие различного встраивания в геном клетки-хозяина и различного состояния геномов после такого встраивания.

Задача получения трансгенных организмов для хозяйственных целей включает в себя также получение коммерциализированных трансгенных организмов без каких-либо селективных и/или маркерных генов. Это обусловлено несколькими причинами:

1 . Потребность минимизировать воздействие на уже сформированный в процессе длительной эволюции генетический аппарат клетки-хозяина и убрать дополнительную метаболическую нагрузку клетки на экспрессию маркерного гена. Все это необходимо для стабилизации самого трансгенного организма и его приобретенного признака, а также для повышения его жизнеспособности.

2. Озабоченность общественного мнения неконтролируемым распространением в окружающей среде селективных и маркерных генов и, прежде всего, генов устойчивости к антибиотикам. Эти опасения можно считать реальными только в случае трансгенных микроорганизмов, поскольку ни один факт природной передачи генов от высших растений или животных к микроорганизмам науке не известен. Кроме того, селективные гены взяты из природных популяций микроорганизмов, где они сейчас широко распространены в результате активного применения антибиотиков в медицинской практике. Поэтому вероятность попадания гена устойчивости к антибиотику в микрофлору человека из природного резервуара несравнимо реальнее, чем, например, при употреблении трансгенных растений. Однако, учитывая настроения общественности, разрабатываются подходы для исключения присутствия «подозрительных» генов в трансгенных формах.

3. Проблемы у потребителей ГМО, вызванные в редких случаях балластным продуктом маркерного гена, например, аллергические реакции на продукт маркерного гена у животных и человека при потреблении генетически модифицированных растений. Хотя в этом случае возникновения проблемы можно не допустить использованием в качестве маркеров генов из традиционных пищевых источников.

4. Необходимость удаления маркерного гена, уже использованного для селекции. Это важно при последовательном введении нескольких генетических конструкций в один организм, поскольку количество эффективных селективных генов ограничено.

Один из экспериментальных подходов к получению безмаркерных эукариотических трансгенных организмов - котрансфекция одного организма двумя генетическими конструкциями: одна - с целевым геном, другая - с маркерным. В этом случае с большой вероятностью (30-80 %) полученный селекцией трансгенный организм содержит и целевой ген, причем обе рекомбинантные конструкции интегрированы в различные локусы хромосомной ДНК. Далее маркерный ген можно удалить с помощью обычного скрещивания.

Другой вариант - использование подвижных генетических элементов для перемещения маркерного гена в другой хромосомный сайт трансгенного организма. Например, при получении трансгенного растения селективный маркер был встроен между растительными подвижными мобильными Ds-элементами рядом с геном транспозазы, которая вырезает встроенную между Ds-элементами ДНК и перемещает ее в другой локус. В процессе встраивания в хромосому растения-хозяина в 50 % случаев маркерный ген находился далеко от целевого гена. Таким образом, селективный маркер может использоваться для отбора трансгенных растений, а потом удаляться скрещиванием.

Разработка высокоэффективных средств доставки ДНК в клетки позволит, наверное, совсем обойтись без селективных и маркерных генов при получении трансгенных организмов. В настоящее время это практически невозможно, по крайней мере, на первых этапах сборки генетической конструкции для трансфекции, которая обычно проводится в клетках E. coli. Но на финальном этапе получения трансгенных организмов существующие способы доставки иногда позволяют получать трансгенные организмы без каких-либо маркерных генов, хотя это более дорогой и трудоемкий вариант.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы