Приемы и способы стерилизации в биотехнологии

04 Января в 15:21 6352 0


Стерилизация (от лат. sterilis - бесплодный) - полное освобождение различных веществ, предметов от живых микроорганизмов. Среди физических факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов, наибольшее значение имеет температура. Простейшим способом стерилизации является обжигание металлических и стеклянных предметов в пламени горелки.

Стерилизация сухим жаром производится в сушильных шкафах при 160-165 °С в течение двух часов. Таким методом стерилизуют лабораторную посуду, металлические предметы, некоторые порошкообразные, не портящиеся при нагревании вещества. Стерилизация водяным паром под давлением производят в автоклавах.

Насыщенный пар под давлением убивает микроорганизмы и споры быстрее, чем перегретый пар. Сухой воздух (жар) убивает микроорганизмы при более высокой температуре, чем водяной пар. Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в результате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых структур микроорганизмов.

Основным недостатком термической стерилизации, несмотря на ее широкое практическое использование, следует считать неизбежные потери питательных свойств среды, поскольку при температурах, необходимых для стерилизации (120-150 °С), большинство субстратов, особенно углеводы, оказываются термически нестабильными.

Осмотическое давление отрицательно влияет на биохимическую активность микроорганизмов. Повышение концентрации солей задерживает развитие многих бактерий, однако есть виды, способные развиваться в присутствии концентрированных растворов солей, такие бактерии называют осмофильными (галофильными). Осмотическое давление в клетке регулирует цитоплазматическая мембрана.

При высоком осмотическом давлении окружающей среды происходит плазмолиз. Плазмолиз явление обратимое, и если понизить осмотическое давление окружающего микроорганизмы раствора, вода поступает внутрь клетки и возникает явление, противоположное плазмолизу.

Ультрафиолетовая компонента солнечного света является главной причиной гибели микробов в наружном воздухе.

Смертность микроорганизмов на открытом воздухе достигает 90-99 %, но зависит от вида микроорганизма и может варьировать от нескольких секунд до пары минут. Споры и некоторые виды бактерий окружающей среды имеют стойкость к воздействию солнечного света и могут переносить длительное облучение светом без особого вреда своему организму. Энергия ультрафиолетовой компоненты солнечного света вызывает повреждения микроорганизмов на клеточном и генетическом уровнях, тот же самый ущерб наносится людям, но он ограничен кожей и глазами.

Искусственные источники ультрафиолетового излучения (УФИ) используют гораздо более сконцентрированные уровни излучения, нежели те, что представлены в обычном солнечном свете. Ультрафиолетовые лучи распространяются по прямой и действуют преимущественно на нуклеиновые кислоты, оказывая на микроорганизмы как летальное, так и мутагенное воздействие. Бактерицидными свойствами обладают только те лучи, которые адсорбируются протоплазмой микроклетки.

Биофизическое действие УФИ на генетический или функциональный аппарат бактерий выглядит следующим образом: излучение вызывает деструктивно-модифицирующее повреждение ДНК, нарушает клеточное дыхание и синтез ДНК, что приводит к прекращению размножения и лизису микробных клеток. В нарушении синтеза ДНК основным является окисление сульфгидрильных групп, что вызывает инактивацию нуклеотидазы и гибель микробной клетки в первом или последующих поколениях.

Сила проникновения ультрафиолетовых лучей невелика. Тонкий слой стекла достаточен для того, чтобы не пропустить их. Действие лучей ограничивается поверхностью облучаемого предмета, его чистота имеет большое значение. УФИ высокоактивно, если микроорганизмы и частицы пыли расположены в один слой, при многослойном расположении верхние защищают нижележащие.

Защитная оболочка вокруг бактериальной клетки препятствует достижению антимикробного действия. В любой живой клетке существуют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру поврежденной молекулы ДНК. Благодаря радиационному мутагенезу, уцелевшие микроорганизмы способны образовывать новые колонии с меньшей восприимчивостью к облучению.

Вероятностный характер стерилизации УФИ изучен в достаточной степени, существуют различные уравнения, характеризующие процесс отмирания бактерий. Эффективность биоцидного действия УФИ зависит от длины волны, интенсивности облучения, времени воздействия, видовой принадлежности обрабатываемых микроорганизмов, расстояния от источника, а также от состояния воздушной среды помещения: температуры; влажности; уровня запыленности; скорости потоков воздуха.

Метод заслуженно считается эффективным для обеззараживания поверхностей, при этом доказаны микробиологическое и экономическое преимущество УФИ или его эквивалентная эффективность химическим методам. При использовании ультрафиолетовых облучателей лимитирующим фактором является предельно допустимая доза облучения людей, а не доза, требуемая для уничтожения микроорганизмов в воздухе помещения.

Влияние ультразвуковых волн. Ультразвуком (УЗ) называются механические колебания с частотой, превышающей 18 кГц (18 000 колебаний в секунду). УЗ получают с помощью высокочастотного генератора, который превращает частоту электросети в электрический ток высокой частоты. Колебания электрического тока высокой частоты посредством пьезоэлектрического преобразователя превращаются в механические колебания, которые передаются в резервуар с жидкостью.

При частоте колебания 1 ,0-1,3 мГц в течение 10 мин оказывает бактерицидный эффект на клетки микроорганизмов. Ультразвук способствует разрыву клеточных стенок и мембран, повреждению флагеллина у подвижных форм микроорганизмов. Влияние ультразвука основано на механическом разрушении микроорганизмов в результате возникновения высокого давления внутри клетки. Это позволяет использовать его в качестве стерилизующего агента, а также применять для инактивации и дезинтеграции вирусов с целью получения антигенов и вирусных вакцин.

Стерилизация инфракрасными лучами. Инфракрасные, или тепловые, лучи составляют часть спектра световой радиации, простирающуюся от красного конца видимого спектра в область длинных волн. Источником инфракрасных лучей являются любые нагретые тела. Практически для этой цели могут быть использованы специальные зеркальные тепловые лампы накаливания, выпускаемые отечественной промышленностью.

Особенность передачи лучистой энергии заключается в том, что промежуточный слой воздуха между термоизлучателем и облучаемым материалом не нагревается и потери тепла в окружающую среду невелики. Различные типы бактерий в разной степени стойки к ультрафиолетовым излучениям. Так, особостойкими являются споры, многие из которых не теряют своих вегетативных свойств.

Высокая влажность воздуха повышает сопротивляемость бактерий, а в тонком слое воды на стерилизацию требуется примерно в десять раз больше энергии по сравнению с той, которая нужна для гибели тех же микроорганизмов в воздухе. С увеличением толщины слоя воды бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей приближаются к нулю.

Стерилизация озоном. Механизм инактивации воздушной микрофлоры озоном очень похож на действие озона в воде.

Сначала озон воздействует на оболочку микроорганизмов путем реакции с двойными связями липоидов. Затем, благодаря способности разрушать дегидрогеназы клетки, озон воздействует на ее дыхание. В результате нарушения проницаемости оболочки и изменения растворимости белков клетка лизируется. Обнаружено проникновение озона внутрь микробной клетки, вступление его в реакцию с веществами цитоплазмы и превращение замкнутого плазмида ДНК в открытую ДНК, что снижает пролиферацию бактерий.

Противовирусное действие озона связывается с разрушением вирусных частиц, инактивацией обратной транскриптазы и влиянием на способность вируса связываться с клеточными рецепторами. Капсулированные вирусы более чувствительны к действию озона. Это объясняется тем, что капсула содержит много липидов, которые легко взаимодействуют с озоном.

Наблюдается известное различие между разными видами микроорганизмов по их сопротивляемости действию озона. Довольно быстро погибают возбудители ангины, дифтерии, различные плесени. Как правило, наиболее устойчивы микробы, покрытые оболочкой, как например туберкулезная палочка и микробные споры. Эффективность стерилизующего действия озона зависит от его концентрации, экспозиции, температуры, влажности, вида микроорганизма, pH и исходной обсемененности обеззараживаемого воздуха.



Озон в низких концентрациях (около 0,2 мг/м3) не очень эффективен для уничтожения бактерий, так как они восстанавливаются спустя некоторое время после обработки. В этих случаях озон оказывает лишь поверхностное действие (контактируя с внешней оболочкой клетки) и незначительно проникает вглубь. Для полной инактивации микрофлоры помещения необходима высокая концентрация озона и длительное время для контакта с микроорганизмами. Оксиды азота усиливают бактерицидные свойства озона, которые в значительной степени зависят от влажности воздуха. При относительной влажности воздуха ниже 45 % озон почти не оказывает бактерицидного действия, а оптимум его активности лежит между 60-80 % влажности.

В профессиональных целях для стерилизации воздуха помещения в присутствии людей генератор озона служить не может, поскольку концентрация озона в несколько раз превышает ПДК для человека. Высокая концентрация выделяющегося озона приводит к деструкции. Таким образом, озонирование высокоэффективно для стерилизации поверхностей и воздушной среды помещения. Невозможность использования метода в присутствии людей и необходимость проводить обеззараживание в герметичном помещении серьезно ограничивает сферу его профессионального применения.

Воздействие химического агента. По химическому составу противомикробные антисептические вещества можно разделить на несколько групп. Например, галогены - препараты йода и хлора, они нарушают ферментативные структуры бактериальной клетки, угнетают гидролитическую и дегидрогеназную активность бактерий, инактивируют такие ферменты, как амилазы и протеазы.

Перекись водорода, перманганат калия, как и галогены, обладают окислительным действием. Кислоты и их соли, щелочи, спирты и альдегиды повреждают поверхностные структуры бактериальной клетки, клеточную стенку и мембраны, нарушая их избирательную проницаемость и другие функции. Соединения тяжелых металлов обладают антиферментным механизмом действия на бактериальную клетку, при этом изменяется структура дыхательных ферментов, и разобщаются процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях.

 Красители обладают денатурирующим эффектом. К антисептическим химическим веществам относятся группы производных 8-оксихинолина и нитрофурана, которые также нарушают биосинтетические и ферментативные процессы в бактериальной клетке. К наиболее распространенным дезинфицирующим средствам относятся хлорсодержащие, фенольные, перекисные и аммониевые соединения.

Стерилизация твёрдых предметов, портящихся при нагревании (некоторые пластмассы, электронная аппаратура и др.), может быть осуществлена обработкой газами (например, окисью этилена в смеси с СО2 или бромистым метилом), спиртом, растворами сулемы.

Стерилизация растворов проводится также путем их пропускания через мелкопористые материалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Широкое применение нашли мембранные фильтры их изготавливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Бактерии задерживаются пористыми перегородками не потому, что диаметр капиллярных ходов фильтра меньше, чем поперечник бактерий, а вследствие молекулярного притяжения и прилипания взвешенных тел к внутренним стенкам пор.

В принципе метод стерилизующей фильтрации является идеальным средством стерилизации лабильных, в том числе термически неустойчивых жидких и газовых сред, поскольку он может быть проведен при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны.

Промышленная очистка и стерилизация воздуха. Как известно, в воздухе содержится взвешенных частиц до 109, в том числе микроорганизмов 0,8-10000 - 100000 на 1 м3. Среди микроорганизмов обнаружены бактерии и их споры, актиномицеты и аспоргенные дрожжи, вирусы и др. Наименьшие размеры, за исключением вирусов, имеют бактерии, диаметр которых 0,5-2,1 мкм и длина до 26 мкм.

Это требует при подготовке воздуха его стерилизации. Отечественный и зарубежный опыт показывает, что технологически и экономически оправданным является многоступенчатый способ продувания воздуха через волокнистые, зернистые или пористые материалы.

Для больших расходов воздуха широко распространена технологическая схема, представленная на рис. 7.15. Воздух на аэрацию в посевные и производственные ферментеры подается с помощью комрессора. Перед сжатием воздух проходит через масляный или сухой фильтры, где осуществляется его очистка от механических примесей. Нагретый в процессе компреммирования сжатый давлением 0,3 МПа воздух охлаждается в теплообменнике. После ресивера воздух охлаждается в теплообменнике для конденсации влаги. Выходящий из ресивера воздух нагревается в кожухотрубном аппарате.

Далее воздух проходит частичную очистку от микроорганизмов в фильтре грубой бактериальной очистки и полностью очищается от микроорганизмов в фильтре тонкой бактериальной очистки. Воздух, выходящий из ферментатора и инокулятора высушивается от влаги на фильтре, достигая расчетной допустимой концентрации микроорганизмов.

Промышленная схема очистки воздуха: 1 - фильтр; 2 - компрессор; 3 - теплообменник; 4 - влагоотделитель; 5 - ресивер; 6 - теплообменник; 7 - головной фильтр (схема Н.А. Войнова)
Рис. 7.15. Промышленная схема очистки воздуха: 1 - фильтр; 2 - компрессор; 3 - теплообменник; 4 - влагоотделитель; 5 - ресивер; 6 - теплообменник; 7 - головной фильтр (схема Н.А. Войнова)

Некоторые конструкции фильтров для биологической очистки воздуха представлены на рис. 7.16. Глубинный фильтр (рис. 7.16, а) представляет собой емкость, снабженную рубашкой с перфорированными решетками внутри. Между решетками укладывается волокнистый фильтрующий материал. В зависимости от напора сжатого воздуха плотность укладки стекловолокнистого фильтрующего материала составляет 100-500 кг/м.

Фильтр с тканью Петрянова (рис. 7.16, б) представляет собой стальной цилиндр с разъемной крышкой и коническим днищем. Внутри фильтра в трубной решетке на резьбе закреплены перфорированные цилиндры, обтянутые слоями ткани через которые проходит воздух и очищается. Фильтр стерилизуется паром с примесью формалина. Необходимая степень биологической очистки воздуха достигается при использовании в качестве фильтрующего материала пористых фильтрующих материалов. Фильтр такой конструкции представлен на рис. 7.16, в.

Известны эффективные металлокерамические фильтрующие элементы для очистки микробных частиц диаметром 0,3 мкм. Особенностью фильтрования с помощью этих элементов является тесная взаимосвязь между формой каналов фильтра с периодически изменяющимся диаметром сечения и скоростью движения воздушного потока в этих каналах. При движении воздуха через материал фильтра в нем возникают ультразвуковые колебания, приводящие к осаждению микроорганизмов на стенки фильтра. На основе фильтрующих металлокерамических элементов разработаны парные автоматические фильтрующие комплексы для грубой и тонкой биологической очистки воздуха.

Схемы фильтров
Рис. 7.16. Схемы фильтров - а: 1 - корпус; 2 - крышка; 3 - решетки со слоем фильтрующего материала; 4 - днище; 5 - вход воздуха; 6 - выход воздуха; 7 - вход острого пара; 8, 9 - выход; б: 1 - корпус; 2 - фланец; 3 - фильтрующий фторопластовый элемент; 4 - прокладка; 5, 6 - вход и выход воздуха; в: 1 - корпус: 2 - крышка; 3 -
фильтр; 4, 5 - выход и вход воздуха (схемы Н.А. Войнова)

Отличительной особенностью таких комплексов является гарантированная микробиологическая надежность очистки и полная автоматизация их работы.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы