Преимущества и проблемы биопродукции в растительной системе

26 Декабря в 13:16 786 0


Биопродукция чужеродных белков в растительных клетках имеет ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего, в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих, но получение трансгенных растений намного проще по сравнению с животными.

Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования (ферментеры), культуральных сред и системы стерильности, стоимость выращивания растений несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей, насекомых или животных. Сельскохозяйственные масштабы продукции позволяют получать рекомбинантные белки и метаболиты в достаточных количествах. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своем составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных препаратов медицинского назначения.

Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве «съедобных вакцин» выделение белка в чистом виде не требуется.

Гликозилирование в клетках высших растений сходно с клетками млекопитающих, но имеются и отличия, которые могут повлиять на биологическую активность синтезируемых рекомбинантных белков в растительной системе. У растений гликопротеины имеют два углеводных остатка, не встречающихся у млекопитающих - в(1,2)-ксилозу и а(1,3) -фукозу (рис. 2.14).

Эти олигосахаридные остатки могут стать аллергенами для человека, поскольку в некоторых экспериментах в крови подопытных животных обнаруживались специфические иммуноглобулины IgE против растительных углеводных детерминант. Различия в гликозилировании у растений и животных могут быть особенно важны при использовании в медицине антител, синтезированных в растениях.

Общая схема гликозилирования белков в клетках животных и растений
Рис. 2.14. Общая схема гликозилирования белков в клетках животных и растений

В животных клетках ключевым ферментом, превращающим N-гликаны растений в N-гликаны млекопитающих, является в(1,4)-галактозилтрансфераза. Если ввести этот ген в растения, можно получить гликозилирование белков по типу клеток млекопитающих. Было проведено скрещивание трансгенных растений табака, синтезирующих этот фермент, с растениями-продуцентами тяжелой и легкой цепей антител.

У полученного потомства, содержащего все три белка, до 30 % иммуноглобулинов имели галактозилированные N-гликаны. Таким образом, существует возможность изменить тип гликозилирования белков человека в трансгенных растениях. Вероятно, эта проблема будет решена тем или иным путем и антитела, синтезированные в растениях, будут широко использоваться в медицине.

Уровень синтеза рекомбинантных белков в растительной клетке.

Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них необходимо отметить частый низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Например, первые эксперименты по экспрессии различных человеческих белков в трансгенном табаке дали очень низкий выход - содержание сывороточного альбумина человека составило приблизительно 0,02 %, эритропоэтина - 0,003 % и b-интерферона -0,001 % от суммарного белка листьев.



Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродного гена, когда ее уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов. Повысить продукцию чужеродных белков в растениях в некоторых случаях удалось введением трансгена в геном хлоропластов, например, в этом случае человеческий сывороточный альбумин составил более 11 % от растворимого белка клеток, человеческий гормона роста - до 7 %.

Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме растительной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляющих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз. Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводненных тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка.

Так, например, уровень синтеза гирудина, слитого с олеозином (белком из масляных телец), в семенах трансгенного рапса достигал 0,3 %. Уровень синтеза под глютелиновым промотором энкефалина человека, направленного в компартменты накопления запасных белков сигнальной последовательностью глютелина (запасной белок риса), составил 2,9 % от тотального белка в семенах арабидопсиса.

Очевидно, что многие проблемы в получении высокоэффективных стабильных трансгенных растений для хозяйственных целей в настоящее время обусловлены недостатком фундаментальных знаний о функционировании генома высших растений. В частности, пока нет ясного понимания того, каким образом происходит включение и выключение генов в ДНК растений.

Сайленсинг генов (gene silencing) - явление «замолкания» генов в последующих поколениях - было обнаружено уже через несколько лет после создания первых трансгенных растений. Было выявлено, что у достаточно заметной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время теряет свою активность - «замолкает», хотя физически сохраняется в геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК.

Как правило, перенесенные гены наследуются согласно законам Менделя, однако к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инактивированием трансгенов. Несмотря на интенсивные исследования этого явления во многих ведущих биотехнологических центрах мира, причины и молекулярно-генетические механизмы все еще остаются до конца не выясненными.

Проблема замолкания генов имеет большое практическое значение, так как у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур трансгены должны функционировать стабильно. За последние годы удалось выяснить механизмы и некоторые условия, способствующие замолканию генов при интеграции в ядерный геном растений. Один из основных факторов -число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов.

Откуда следуют практические рекомендации генным инженерам: трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; сигнальные части и регуляторные части чужеродной ДНК (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100-300 нп) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед встраиванием рекомбинантной ДНК в растительные клетки.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы