Построение генетических карт хромосом

27 Декабря в 19:52 10428 0


Сиквенс генома - это всего лишь последовательность из одних и тех же четырех букв в бесконечной вариации. Взглянув на нее, никто не сможет мгновенно вычислить ее функцию. Однако, вставив последовательность оснований на правильное место в геноме, можно получить ключ к разгадке ее функции. Карта генома - это графическая схема, позволяющая исследователям ориентироваться в геноме, искать в нем места, которые могут быть важны и интересны.

В простейшем виде карта генома представляет собой линию, по всей длине которой расположены различные ориентиры, помеченные буквами и цифрами, дающие возможность исследователю идентифицировать отдельные признаки. Карта не одно и то же, что и последовательность оснований генома. Расположение генов на карте можно вычислить без определения последовательности оснований. Приблизительная локализация генов, нарушения в которых связаны с рядом наследственных заболеваний, была установлена задолго до секвенирования генома человека при исследовании наследования различных сцепленных признаков. Методы, которые используются при этом, подробно излагаются в курсе «Генетика». Здесь же мы затронем лишь общие закономерности части из них.

Как проводится построение генетические карты? Предположим, что необходимо выяснить расположение определенного гена, вызывающего заболевание, которое выражается определенными фенотипическими признаками. Сначала обследуют несколько семей, представленных несколькими поколениями, члены которых страдают этим заболеванием, чтобы узнать, с какими другими генетическими признаками связана эта болезнь.

Гены любых признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенностью к болезни, с большой долей вероятности могут быть локализованы на одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Их выбирают в качестве маркеров для искомого гена. Определив несколько маркеров с известным расположением на хромосоме, можно с большой точностью (до нескольких миллионов п.о. ) установить расположение гена, вызывающего болезнь.

Затем исследования фокусируются на части генома, несущей указанный ген, и поисках гена, который имеет различную последовательность оснований у здоровых и больных людей, или гена, функции которого могут быть связаны с болезнью. Именно так были идентифицированы гены, связанные с фиброзом мочевого пузыря и болезнью Гантингтона. Однако путь этот долог и трудоемок, поэтому целью генетиков остается разработка более детальных карт геномов, которые позволят с точностью находить последовательности, нужные в каждом конкретном случае.

Существует два типа генетических карт - карты генетического сцепления и физические карты.

Карты генетического сцепления показывают порядок расположения генов на хромосоме и относительные расстояния между ними. Впервые такую карту составили в начале ХХ в. в лаборатории Колумбийского университета, возглавляемой Томасом Г. Морганом (лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине, 1933 г.). Объектом этих классических генетических исследований были избраны плодовые мушки Drosophila melanogaster, мелкие размеры и неприхотливость которых позволяли проводить эксперименты с сотнями мух.

Кроме того, они быстро размножались и оказались чрезвычайно плодовитыми - новое поколение появлялось через каждые 12 сут, и самка откладывала до 1 000 яичек. Плодовые мушки имеют 4 пары хромосом, включая пару половых. Морган заметил, что если самца с белыми глазами скрестить с красноглазой самкой, то у потомства глаза будут красными; но при скрещивании потомства друг с другом «белоглазость» проявляется вновь, но только у самцов. Морган сделал вывод, что этот признак и другие «ограниченные полом» признаки, например, дальтонизм у людей, который поражает только мужчин, должны располагаться на Х-хромосоме.

Это была первая мутация, связанная с определенной хромосомой. В течение нескольких последующих лет были идентифицированы более 40 мутаций у плодовых мушек, часть из которых оказались сцепленными друг с другом. Сейчас различают четыре основных вида наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный (относится к 22-м парам неполовых хромосом), а также Х-сцепленный доминантный и Х-сцепленный рецессивный.

Схема эксперимента Моргана с белоглазыми мушками приведена на рис. 3.1. Этот эксперимент демонстрирует случай Х-сцепленного рецессивного наследования. Итак, гены сцепленных признаков расположены на одной хромосоме. Для определения сцепления генов группа Моргана скрещивала мутантов с нормальными мушками и полученное потомство снова и снова, пока не получали достаточное количество мушек с сохранением мутации на определенной хромосоме.

Поскольку их расположение было известно, такие мутации служили маркерами. Затем самцов с новой мутацией скрещивали с самками, несущими эти маркерные мутации. Как уже было отмечено, белые глаза были результатом мутации на Х-хромосоме. Если новая мутация постоянно проявлялась у белоглазых мух, это означало, что и она расположена на Х-хромосоме.

Результаты скрещивания белоглазых мушек с красноглазым самцом. Черными треугольниками помечены Х-хромосомы, несущие доминирующий признак красных глаз. Белыми перевернутыми треугольниками обозначены Х-хромосомы, несущие рецессивный признак белых глаз. Серые треугольники - Y-хромосомы
Рис. 3.1. Результаты скрещивания белоглазых мушек с красноглазым самцом. Черными треугольниками помечены Х-хромосомы, несущие доминирующий признак красных глаз. Белыми перевернутыми треугольниками обозначены Х-хромосомы, несущие рецессивный признак белых глаз. Серые треугольники - Y-хромосомы

Однако встречались признаки, которые передавались вместе, но не всегда, например, признаки белого глаза и рудиментарного крыла. Этот эффект объясняется происходящим во время мейоза кроссинговером (обменом между генными участками хромосом). Если интересующие нас гены находятся на одной и той же хромосоме, но располагаются далеко друг от друга, в результате кроссинговера при образовании половых клеток они с большой вероятностью попадут в разные клетки. Близко расположенные гены не будут разделяться при кроссинговере.

Таким образом, можно установить не только нахождение гена на определенной хромосоме, но и приблизительно определить взаимное расположение генов на ней, если учесть, как часто они проявляются в потомстве в результате скрещиваний. Пользуясь полученными результатами, сотрудники лаборатории Моргана построили первую карту Х-хромосомы плодовой мушки (рис. 3.2). Позднее были построены первые генетические карты и других 3 хромосом. По сути, они являются прототипом современных генетических карт.


Примерный вид первой генетической карты, показывающей расположение пяти признаков на хромосоме плодовой мушки
Рис. 3.2. Примерный вид первой генетической карты, показывающей расположение пяти признаков на хромосоме плодовой мушки

Карты Моргана были построены на генетических признаках, физически видимых у исследуемых мушек. Сегодня гораздо более сложные карты сцепления генов строятся на определении наследования специфических последовательностей ДНК. В частности, для этого используется метод, основанный на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Для возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена отличались всего одним нуклеотидом. Если вероятность появления такой замены (мутации) больше 1 %, то говорят, что имеет место генетический полиморфизм. Замена всего одного нуклеотида может вызвать значительное изменение свойств кодируемого белка, по сравнению с нормальным.

Однако множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных генных продуктов. Более того, замены, происходящие в некодирующих областях (а в человеческом геноме они составляют около 90 %), не приводящие ни к каким изменениям, распределены по всей длине хромосомы и представляют собой полиморфные сайты, которые используются в качестве маркеров для генетического маркирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно обнаружить.

Метод состоит в следующем. ДНК расщепляют с помощью определенной рестриктазы по специфическим местам. Если в сайте рестрикции находится однонуклеотидная замена, рестриктаза его не узнает и расщепления не происходит. В то же время она по-прежнему узнает и расщепляет интактный сайт в другой хромосоме. Таким образом, в результате обработки рестриктазой двух этих аллелей получается набор разных продуктов (фрагментов ДНК разной длины), которые затем опознаются с помощью гибридизации со специфичным зондом.

Явление встречающегося в популяции измененного сайта рестрикции, приводящее к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов. Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. В настоящее время идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов, благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований.

Определение аллелей ПДРФ-локуса, присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется генотипированием (ДНК-типированием). Наследование ПДРФ-локусов происходит в соответствии с законами Менделя и можно проследить их передачу в пределах родословной. Используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хромосомную локализацию этого гена. С их помощью были изолированы гены таких наследственных заболеваний, как миодистрофия Дюшена и муковисцидоз.

Другим типом полиморфных локусов являются так называемые короткие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats). Дело в том, что по геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков динуклеотидных повторов, содержащих до 40 CA/GT-элементов. Любой такой блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. В геноме встречаются также повторы (AT)n, (ATG)n, (ATCG)n.

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, проводят скрининг геномной библиотеки человека, содержащий вставки небольшого размера (около 1 000 п.о.), используя подходящий олигонуклеотидый зонд. Для (СА)n-повторов обычно используют зонд (CA)15. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийными, проводят гибридизацию с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и осуществляют амлификацию СА-повторов.

Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученных от большого числа индивидуумов. Длина ПЦР-продуктов (применяют примерно 200 п.о.) определяется с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Если длина амплифицированного таким образом сегмента одинакова для всех исследуемых образцов ДНК, значит повтор не полиморфен и наоборот, если образуются ПЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному STR (STR-полиморфизм, STRP).

Различающиеся по длине повторы данного локуса представляют собой аллели, которые встречаются с частотой 20 % и более. Использование STRP-локусов для картирования геномов, по сравнению с ПДРФ-локусами, имеет ряд преимуществ:
1) для их идентификации нужна информация о нуклеотидной последовательности только пары праймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных;
2) эти локусы равномерно распределены в геноме;
3) их частоты очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность;
4) они без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации.

Физическая карта целой хромосомы или ее области дает непосредственное представление о расположении генов в ДНК, что облегчает их идентификацию и характеристику. Существующие в настоящее время, после завершения секвенирования генома человека, геномные карты совмещают черты обоих типов карт. Созданы электронные сайты, где специалисты могут получить информацию о содержании различных хромосомных карт, включая их полное графическое изображение, о методах исследования генома и программном обеспечении.

На рис. 3.3. показана карта хромосомы Micobacterium tuberculosis. Сравнение последовательностей клинического штамма CDC1551 и лабораторного H37Rv позволило выявить мутации (замены и вставки), ответственные за патогенность клинического образца, что в свою очередь позволяет улучшить метод диагностирования, понять механизм возникновения заболевания и предложить соответствующую эффективную терапию.

Карта генома хромосомы Micobacterium tuberculosis
Рис. 3.3. Карта генома хромосомы Micobacterium tuberculosis. На внешней окружности показано расположение генов, кодирующих соответствующие белки, общие для штаммов CDC1551 (клинический) и H37Rv (лабораторный). Каждая из внутренних окружностей отражает различия между этими штаммами. Например, вторая окружность показывает локализацию синонимных замен, пятая - обнаруженные в штамме CDC1551 вставки и т.д. [1] (с разрешения American Society for Microbiology)

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы