Полимеразная цепная реакция. Общая схема молекулярного клонирования

26 Декабря в 10:07 3836 0


Полимеразная цепная реакция

Появление метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1983 г. существенно продвинуло, ускорило и удешевило молекулярное клонирование, сделав возможным быстрый синтез (амплификацию) прямо в пробирке нужных последовательностей из считанных исходных копий. Впоследствии за изобретение ПЦР американский ученый К. Мюллис (K. Mullis) получил Нобелевскую премию.

ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся стадий реакции (15-30 циклов по 1 -3 мин):
1) тепловая денатурация исходной ДНК при ~94 °С;
2) отжиг ДНК-затравок (праймеров) при ~50-60 °С на получившиеся одноцепочечные матрицы;
3) синтез двухцепочечных ДНК при 72 °С с каждым из праймеров навстречу друг другу по противоположным цепям ДНК (рис. 2.2).

Три цикла полимеразной цепной реакции, или амплификации ДНК
Рис. 2.2. Три цикла полимеразной цепной реакции, или амплификации ДНК. Серым цветом в исходной ДНК выделен целевой фрагмент для синтеза, который в процессе реакции ограничивается праймерами. В идеальных условиях реакции количество целевого фрагмента удваивается каждый цикл (2n), количество исходных цепей увеличивается на две каждый цикл (n + 2, где n- количество циклов)

Реакцию проводят в специальном приборе - термоциклере, или амплификаторе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок. По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества исходных копий ДНК в геометрической прогрессии.

В качестве праймеров используются короткие (15-25 нуклеотидных оснований) одноцепочечные ДНК - олигонуклеотиды, комплементарные концам целевого фрагмента ДНК. Важнейшим компонентом ПЦР являются термостабильные ДНК-полимеразы, способные сохранять активность на протяжении всей реакции ПЦР, несмотря на воздействие высоких температур на стадии тепловой денатурации ДНК. В настоящее время имеется широкий спектр коммерческих полимераз с разнообразными свойствами, но пока наиболее используемой остается Taq-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus с оптимумом активности при 72 °С и ее смеси с другими ДНК-полимеразами.

В настоящее время ПЦР широко используется в научных и диагностических лабораториях во многих областях. Кроме простого удвоения последовательностей ДНК, метод ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), клонирование любых последовательностей в пробирке, выделение новых генов, секвенирование. Также ПЦР широко используется в биологической и медицинской практике, в первую очередь, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, степени родства, популяционных исследований, в криминалистике - везде, где нужно установить уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала.

Общая схема молекулярного клонирования

Технологии рекомбинантных ДНК - это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать. Не существует единого универсального набора методик, все зависит от конкретной задачи, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме (рис. 2.3).

1. Получение нужной последовательности - ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК и путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикционной эндонуклеазой. Но самый распространенный путь сейчас - синтез ДНК методом ПЦР. В настоящее время, когда секвенирование целых геномов различных организмов идет быстрыми темпами, сложно найти совсем неизвестный ген. Даже для млекопитающих, включая человека, секвенированы уже 25 геномов (по публичной базе данных NCBI Genome на август 2008 г.), из них 9 собраны полностью с установлением генной структуры. И это не считая расшифрованных геномов менее сложных организмов.



Учитывая генетическое родство всех живых организмов на Земле, самая распространенная ситуация в настоящее время - когда целевая последовательность для предполагаемого клонирования известна, хотя бы частично. После выбора и синтеза праймеров к известной последовательности, ДНК можно амплифицировать методом ПЦР с использованием в том числе и вырожденных праймеров (с неполной комплементацией).

В качестве матрицы для синтеза используют геномную ДНК или матричную РНК, в этом случае первым шагом в синтезе целевой последовательности будет синтез комплементарной ДНК (кДНК) обратной транскриптазой (ревертазой - РТ), затем обычная ПЦР. Иногда эти реакции объединяют в одну РТ-ПЦР (RT-PCR). Как правило, в концы ПЦР-праймеров вводят сайты рестриктаз для удобства дпльнейшего клонирования синтезированной последовательности (рис. 2.3).

Общая схема молекулярного клонирования на примере трансформации бактерий или дрожжей рекомбинантным плазмидным вектором
Рис. 2.3. Общая схема молекулярного клонирования на примере трансформации бактерий или дрожжей рекомбинантным плазмидным вектором

Нужную последовательность ДНК также можно получить химико-ферментативным синтезом, при этом производят сборку полноразмерного гена из отдельных синтетических олигонуклеотидов различными способами. Химический синтез гена осуществляют, как правило, когда организм-донор ДНК не доступен или когда нуклеотидная последовательность природного гена может плохо транслироваться в выбранном организме-рецепиенте вследствие несовпадения частоты использования кодонов, а также по другим причинам. Химико-ферментативный синтез гена можно заказать в ряде биотехнологических фирм, в том числе и в России.

2. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы - конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК». Вектор для клонирования - общий термин, обозначающий молекулу ДНК, способную к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулой-носителем, подобно космической ракете-носителю, для клонируемой ДНК.

3. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень (рецепиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией (в основном для прокариот и дрожжей) и трансфекцией (в случае эукариот). В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина.

4. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Например, высевают трансформированные клетки на селективную среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому несет использованный вектор - расти будут только колонии (клоны) рекомбинантных клеток.

5. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы