Основные закономерности хроматографического разделения в колонке

04 Января в 8:38 1738 0


Параметры удерживания. Время удерживания и удерживаемый объем. Разделение в хроматографии основано на различной сорбируемости анализируемых соединений при движении их по слою сорбента в колонке. Если соединение не сорбируется, то оно не удерживается сорбентом в колонке, и будет выходить из колонки со скоростью потока элюента. Если же вещества сорбируются, то они удержатся в колонке, это будет определяться их сорбционной способностью: чем сильнее сорбция соединения, тем дольше оно будет удерживаться в колонке.

Параметры удерживания, по существу, характеризуют сорбционную способность анализируемых соединений. Различие в сорбируемости в конечном итоге определяется различием межмолекулярных взаимодействий вещество - сорбент. Время от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума пика называется временем удерживания tR (рис. 6.6).

Оно складывается из двух составляющих: времени нахождения молекул соединения в элю-енте (tjj) и времени нахождения молекул соединения в сорбируемом состоянии (tR):
tR = tм + R' (6.4)

Параметры удерживания
Рис. 6.6. Параметры удерживания

Для газовой и жидкостной хроматографий время нахождения молекул исследуемого соединения в элюенте зависит от доли пустот в колонке. В разных набивных колонках плотность набивки может изменяться, будет также изменяться и величина tм поэтому для характеристики истинной удерживающей способности необходимо определять величину tR - так называемое приведенное время удерживания:
tR = /м - tR, (6.5)
Величину tм определяют по времени выхода несорбируемого соединения (иногда называемого мертвым временем).

Приведенное время удерживания зависит от скорости элюента: чем больше скорость элюента, тем меньше время удерживания, поэтому на практике удобнее использовать удерживаемый объем VR - произведение времени удерживания на объемную скорость элюента Fr:
Vr = tR • Fr, (6.6)
Удерживаемый объем - это объем элюента, который необходимо пропустить через хроматографическую колонку, чтобы элюировать данное анализируемое соединение. Приведенный удерживаемый объем (V'R) соответственно равен:
V'r = (tR - tм) Fr = tRFr - tмFr = Vr - Vd, (6.7)
где Vd - объем пустот в колонке (мертвый объем).

Объемную скорость элюента чаще всего измеряют на выходе из колонки. Из-за сжимаемости элюента при повышении давления объемная скорость неодинакова по длине колонки. В начале колонки она меньше, чем на выходе, поэтому для определения средней скорости в колонке вводится специальная поправка j, учитывающая перепад давления:
специальная поправка j, учитывающая перепад давления, (6.8)

где p1 - входное давление; p0 - давление на выходе колонки.

Приведенный удерживаемый объем с поправкой на среднее давление называется чистым удерживаемым объемом:
VN = V'R • j. (6.9)
Чистый удерживаемый объем можно считать физико-химической константой, так как он не зависит от скорости элюента при постоянной температуре и доли пустот в колонке.

Чистый удерживаемый объем зависит от количества сорбента в колонке, поэтому для точных физико-химических измерений используют понятие удельного удерживаемого объема (VTg). Величина Vg - это чистый удерживаемый объем, отнесенный к массе сорбента g в колонке или к площади поверхности адсорбента SK при усредненном давлении в хроматографической колонке и температуре T колонки:
Величина Vg, (6.10)

Относительные параметры удерживания. Все рассматриваемые выше параметры удерживания зависят от случайных небольших колебаний параметров опыта, в частности расхода элюента и температуры термостата колонки. Для исключения этих влияний используют относительные параметры удерживания. При расчете относительного параметра удерживания (времени или объема) берут отношение чистого объема удерживания исследуемого вещества к чистому объему удерживания стандартного соединения:
При расчете относительного параметра удерживания (времени или объема), (6.11)

В газовой хроматографии в качестве стандартных соединений используют н-алканы, с параметрами удерживания, близкими к параметрам удерживания исследуемого вещества. В этом случае при случайных колебаниях расхода или температуры абсолютные параметры удерживания будут изменяться, а их отношения - практически нет.

В качестве относительного параметра широко используют индекс Ковача:
индекс Ковача, (6.12)
где tn, tn+1 - приведенные времена удерживания н-алканов, с числом атомов углерода в молекуле n и n + 1; t'n - приведенное время удерживания исследуемого соединения. Индекс Ковача - безразмерная величина и может быть подсчитана с большой точностью, например в капиллярных колонках -до сотых долей процента. Индексы Ковача в первую очередь применяют для идентификации неизвестных веществ (проведение качественного анализа).

Изменения индексов Ковача для соединений, отличающихся природой функциональной группы, используют для оценки межмолекулярных взаимодействий. Индексами удерживания определенного набора стандартных веществ характеризуют полярность неподвижных жидких фаз и адсорбентов.

Параметры хроматографического пика. Выходной сигнал анализируемого соединения имеет форму треугольника или пика, обычно это участок нулевой линии, на котором возникает сигнал при выходе анализируемого соединения из хроматографической колонки. Нулевая или базовая линия соответствует участку нулевой концентрации анализируемого соединения.

Запись пика исследуемого соединения вместе с участками нулевой линии до и после пика называется хроматограммой. Высота пика - это расстояние от максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика детектора. Ширина пика у основания - отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика. Ширина пика на полувысоте -отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика на середине его высоты. Площадь пика - это площадь части хроматограммы, заключенной между пиком и его основанием.

Важным параметром пика является коэффициент асимметрии, который применяется для сравнения различных твердых носителей, адсорбентов и всей системы хроматографа в целом. В идеальных условиях пик по форме близок к кривой Гаусса, т.е. симметричен. На практике пики по разным причинам в основном несимметричны. Асимметрия пиков ухудшает разделение и затрудняет количественную обработку.

Асимметричные пики появляются при разделении на неоднородных сорбентах, когда концентрации анализируемых соединений соответствуют нелинейным участкам изотермы сорбции. Кроме того, это может быть вызвано в некоторых случаях кинетикой сорбции (замедленный процесс десорбции), наличием непродуваемых полостей. Асимметрию пиков оценивают относительно полуширин пиков на половине высоты (рис. 6.7) отношением отрезка БВ к АБ либо на 1/10 высоты пика от основания отношением отрезков ДЕ к ГД. Точнее пользоваться отношением площадей половин пика - отношением заштрихованной части пика к незаштрихованной части (рис. 6.7).



Оценка асимметричности пиков
Рис. 6.7. Оценка асимметричности пиков

Асимметрия пиков может быть вызвана размыванием полос в колонке. Обычно выделяют три вида размывания полос:
- размывание, связанное с различной скоростью движения по слою сорбента зон с разной концентрацией (зависит от формы изотермы сорбции);
- диффузионные размывания (молекулярная диффузия, вихревая диффузия, динамическое размывание, стеночный эффект);
- кинетическое размывание, связанное со скоростью внешнего и внутреннего массообмена.

Первый вид размывания наблюдается в том случае, когда концентрация вещества соответствует нелинейному участку изотермы сорбции. На рис. 6.8 показано размывание полос для различных типов изотерм. В случае нелинейности изотермы сорбции линейная скорость перемещения зоны вещества по слою сорбента
Uc = U/a/c, (6.13)
где U - линейная скорость элюента.

При линейной изотерме сорбции (изотерма Генри) отношение а/с постоянно во всем диапазоне концентраций, поэтому искажение формы зон не происходит, следовательно, зарегистрированный пик будет симметричным. В случае нелинейной изотермы сорбции отношение а к с изменяется с концентрацией. Для выпуклой изотермы (изотермы Лэнгмюра) с повышением концентрации величина а/с уменьшается, а скорость продвижения участков зон с большими концентрациями возрастает.

В случае вогнутой изотермы (рис. 6.8, в), наоборот, скорость продвижения участков зон с меньшими концентрациями будет больше. Это единственный вид размывания, который можно полностью исключить. Для этого нужно выбрать адсорбент с однородной поверхностью с линейной изотермой для анализируемых концентраций.

Размывание полос для различных типов изотерм: а - линейная изотерма; б - изотерма Лэнгмюра (выпуклая изотерма); в - вогнутая изотерма
Рис. 6.8. Размывание полос для различных типов изотерм: а - линейная изотерма; б - изотерма Лэнгмюра (выпуклая изотерма); в - вогнутая изотерма

Молекулярная диффузия. В хроматографических колонках это размывание рассматривают вдоль колонки, размывание в других направлениях ограничено стенками колонки, поэтому в этом случае часто используют термин «продольная диффузия».

Вихревая диффузия имеет место только в набивных колонках и определяется неоднородностью набивки, разным сопротивлением потоку в разных частях сечения колонки. Общий поток элюента при попадании в колонку распадается на отдельные микропотоки между зернами. Если сопротивление по сечению неоднородно, то там, где сопротивление меньше, микропоток будет продвигаться быстрее; наоборот, там, где сопротивление больше, микропоток будет двигаться медленнее. Это приведет к дополнительному размыванию. Чтобы уменьшить вклад вихревой диффузии, нужно уменьшать размер зерен, использовать более узкий фракционный состав зерен, исключать пыль и заполнять колонку с максимальной плотностью.

Динамическое размывание наблюдается в пустых незаполненных (т.е. капиллярных) колонках, оно связано с профилем скоростей по сечению в пустых трубках. В центре скорость потока больше, чем у стенок, в результате происходит искажение формы полосы и имеет место дополнительное размывание.

Стеночный эффект. Плотность набивки на единицу объема около стенок всегда меньше, а доля пустот больше, чем в центре колонки, особенно при использовании зерен крупного размера. Это приводит к тому, что скорость элюента около стенок больше, чем в центре колонки. В результате возникает дополнительное размывание, так называемый стеночный эффект.

Стеночный эффект может вносить большой вклад, когда диаметр колонок значительно больше высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ), т.е. в препаративной хроматографии. В аналитических колонках небольшого диаметра (внутренний диаметр 2-4 мм) размывание за счет стеночного эффекта мало и им пренебрегают.

Кинетическое размывание. Задержка массообмена с поверхностью адсорбента вследствие медленности процессов адсорбции и десорбции также приводит к размыванию полосы. Задержка при адсорбции приводит к продвижению компонента вперед, т.е. к размыванию переднего фронта полос, а задержка при десорбции приводит к размыванию заднего фронта. В том случае, когда скорости адсорбции и десорбции неодинаковы, такое размывание может быть несимметричным.

Все перечисленные причины искажения хроматографических пиков можно описать математическими зависимостями, а их суммарное действие выразить уравнением Ван-Деемтера:
H = A + B/U + cU, (6.14)
где каждое из трех слагаемых по порядку соответствует ранее описанным факторам: А - степень неоднородности структуры упакованного в колонку сорбента; В - коэффициент, учитывающий вклад диффузии данного сорбата в подвижной и неподвижной фазах; с - константа, определяющая массообмен сорбата между сорбентом и элюентом; U - линейная скорость потока элюента.

На графике зависимости Н (высота эквивалентной теоретической тарелки) от U (рис. 6.9) можно в общем виде оценить величины А, В и с. Обращает на себя внимание несимметричность ветвей кривой, следовательно, превышение оптимальной скорости потока ведет к меньшей потере эффективности, чем работа колонки со скоростью потока ниже оптимальной.

График зависимости H от U (уравнение Ван-Деемтера)
Рис. 6.9. График зависимости H от U (уравнение Ван-Деемтера)

Размывание приводит к уширению пика, что отражается на эффективности, которая выражается числом теоретических тарелок N и вычисляется по формуле
Размывание приводит к уширению пика, что отражается на эффективности, которая выражается числом теоретических тарелок N (6.15)
где tf - время удерживания данного компонента; t* - время выхода пика от половины его высоты на подъеме, до половины высоты на спаде.

Отношение длины колонки к ее эффективности называется высотой эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) - Н. Обе эти величины имеют конкретный смысл: для N - число актов сорбции-десорбции, произошедших с веществом при его движении по колонке; для Н - высота слоя сорбента в колонке, на котором происходит единичный акт сорбции-десорбции. Следовательно, эффективность прямо пропорциональна длине колонки.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы