Основные типы клонирующих векторов

26 Декабря в 10:15 5261 0


Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали бактериальные плазмиды - внехромосомные автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами - фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК были сконструированы искусственные хромосомы.

С развитием знаний о генетических элементах и совершенствованием методов генной инженерии новые векторы под конкретные задачи начали собирать из отдельных блоков - различных хорошо охарактеризованных генетических элементов (см рис. 2.6). В настоящее время имеется огромное количество коммерчески доступных разнообразных синтетических векторов, сконструированных практически под любые задачи.

Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на размер вставок чужеродной ДНК. Основные типы современных векторов рассмотрены ниже.

Плазмидные векторы - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей -три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества.

В одной клетке могут сосуществовать только плаз-миды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн.

Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке - количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного вектора рассмотрена более подробно далее (см. рис. 2.7).

Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.

Вирусные векторы. Рассмотрим основные из них.

Бактериофаг лямбда имеет линейную молекулу ДНК с 48,5 тпн. Емкость клонирующих векторов была существенно повышена с разработкой векторов на основе фага лямбда. Центральную треть вирусного генома можно заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага, клонирующий лимит от 8 до 24 тпн, что составляет половину генома лямбды дикого типа (рис. 2.4).

Фаг лямбда под электронным микроскопом (а), схема его строения (б) и упрощенная генетическая карта (в)
Рис. 2.4. Фаг лямбда под электронным микроскопом (а), схема его строения (б) и упрощенная генетическая карта (в). Выделенный серым цветом участок соответствует генам, несущественным для литического пути развития фага (гены, обеспечивающие существование в виде профага), вместо которых может быть встроена чужеродная ДНК

Механизм упаковки бактериофага в зрелые вирионы основан на включении ДНК строго определенного размера, что стабилизирует ДНК-вставки и позволяет легко освобождаться от нерекомбинантных молекул. Упаковку сконструированных in vitro молекул на основе фага лямбда производят в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизогенных по бактериофагам с разными дефектами. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов Е. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Векторы на основе фага лямбда являются одними из самых распространенных для создания библиотек генов.

Космиды - кольцевые молекулы ДНК, объединяющие свойства фага и плазмиды, содержат ориджин репликации и соs-сайты фага лямбда. Сконструированы для клонирования больших фрагментов ДНК в 35-50 тпн. Для упаковки ДНК в фаговую головку вирусный аппарат фага лямбда требует только наличия соя-сайтов на расстоянии 36-51 тпн. Гибридные молекулы космиды с большими вставками в 35-50 тпн между соя-сайтами упаковываются in vitro в виде инфекционных вирионов при использовании экстрактов фагов дикого типа. Естественно, такие фаговые частицы нежизнеспособны, после инфекции космиды существуют в бактериальной клетке как плазмиды.

Нитевидные бактериофаги - М13 (рис. 2.5), fd, f1 бактерии E. coli. Представляют собой одноцепочечную кольцевую ДНК, упакованную в белковую трубочку из одинаковых белковых субъединиц, двухцепочечная репликативная форма похожа на плазмиду. Вставки чужеродной ДНК до 1 тпн очень стабильны. Наиболее широко ранее использовались векторы на основе фага М13. До появления метода ПЦР, который позволяет секвенировать сразу двухцепочечные молекулы ДНК, одноцепочечные матрицы для секвенирования получали клонированием в М13-вектор.



Нитевидный бактериофаг М13 под электронным микроскопом (а) и упрощенная схема его строения
Рис. 2.5. Нитевидный бактериофаг М13 под электронным микроскопом (а) и упрощенная схема его строения. На геномной карте (б) затемненные области отмечают несущественные для жизнеспособности вируса участки, куда возможна вставка чужеродной ДНК. Удлинение генома рекомбинантного фага при инсерции чужеродной ДНК приводит к образованию более длинных нитей вирионов, чем у фага дикого типа

В настоящее время клонирование в векторы на основе М13 и fd преимущественно используют в методе фагового дисплея (получение и анализ пептидных библиотек для различных целей, например, для исследования белок-белковых, белок-пептидных, белок-ДНК взаимодействий, для эволюции белков in vitro, получения иммунологических реагентов нового поколения и др.). При этом чужеродную ДНК встраивают в гены белков вирусной оболочки, затем клонированные последовательности выявляются на поверхности вирусных частиц в виде гибридных белков (фьюжин-белков).

Бакуловирусы - большая и разнообразная группа вирусов. Поражают насекомых и других членистоногих, но абсолютно безвредны для позвоночных. Геном представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, варьирующей в размере от 80 до 180 тпн. Замена несущественной для репликации части вирусного генома позволяет клонировать чужеродную ДНК до 15 тпн. Внедрение чужеродной ДНК происходит путем гомологичной рекомбинации (двойной кроссинговер) бакуловируса с небольшим плазмидным транспортным вектором, содержащим клонированный ген.

Данная система экспрессии позволяет осуществлять большинство посттрансляционных модификаций (гликозилирование, ацилирование, протеолитическое расщепление и др.), недоступных в прокариотической системе. В настоящее время векторы на основе бакуловирусов широко используются для продукции различных эукариотичеких белков в клетках насекомых. Также бакуловирусы применяются как биологические инсектициды.

Для клеток высших эукариот эффективные векторы созданы на основе хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины, вируса герпеса и др. Ретровирус-ные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных. Необходимо отметить, что при использовании вирусов в качестве векторов для животных клеток никогда не сохраняется нативный вирус - используются лишь некоторые регуляторные последовательности вируса для конструирования вектора.

Особенности молекулярной организации векторов для доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки рассмотрены далее.

Искусственные хромосомы. Разработка векторов типа искусственных хромосом началась для решения задачи клонирования и стабильного наследования больших фрагментов ДНК, например, для физического картирования генома в проектах расшифровки геномов, для стабильной экспрессии обширных генных комплексов в трансгенных клетках, для внедрения таких комплексов и отдельных генов в клетку-мишень без нарушения ее хромосомных структур и т.д.

Бактериальные искусственные хромосомы (bacterial artificial chromosomes - BAC) сконструированы на основе полового фактора F E. coli со строгим контролем репликации. Его генетическая система обеспечивает правильное распределение фактора F между делящимися клетками и поддерживает его копийность в 1-2 молекулы на клетку. BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК в 75-300 тпн.

Дрожжевые искусственные хромосомы (yeast artificial chromosomes -YAC) - линейная ДНК, которая имеет все необходимое для репликации в дрожжах: теломеры, несколько сайтов инициации репликации (репликонов), дрожжевую центромеру (рис. 2.6). Также дополнительно содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных клеток. Клонирующий лимит - 100-1 000 тпн.

Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек. Причем, структурная стабильность протяженных вставок ДНК в BAC-системе существенно выше, чем в YAC-системе, чем обусловлено широкое использование BAC-системы при физическом картировании генома человека, по которому затем собиралась его полная последовательность.

Основные элементы конструкции дрожжевой искусственной хромосомы
Рис. 2.6. Основные элементы конструкции дрожжевой искусственной хромосомы

Дальнейшее развитие этого направления привело к созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (mammalian artificial chromosomes - MAC). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы