Органогенез в культуре соматических тканей

28 Декабря в 20:02 3027 0


Манипуляции в культуре изолированных тканей растений (с использованием или без культуры каллусных клеток) чаще всего осуществляют в соматических тканях.

Реализация тотипотентности соматических клеток лежит в основе вегетативного размножения растений. Отрезки стеблей, корней и листья растений разных таксономических групп способны к регенерации новых побегов и корней.

При культивировании in vitro эти возможности могут быть значительно увеличены, а у растений, не проявляющих регенерационной способности в природных условиях, индуцированы.

Прямой и непрямой пути органогенеза

Если при культивировании развитие корней, стеблевых или цветочных почек происходит из клеток экспланта без образования каллуса, то такой путь органогенеза называют прямым. Путь формирования морфологических структур, приводящих к образованию корней, стеблевых и цветочных почек в каллусной культуре, называют непрямым органогенезом.

Пример прямого органогенеза in vivo и in vitro - образование стеблевых почек у льна. Так, если у 15-дневных проростков льна удалить верхушку стебля, то через определенный промежуток времени из эпидермальных клеток гипокотиля происходит образование многочисленных стеблевых почек. Позже одна из почек доминирует в развитии и дает полноценный стебель. Если сегмент гипокотиля льна размером примерно 15 мм поместить на агаризованную культуральную среду с фитогормонами, то развитие может получить до 170 проростков, формирующихся как из эпидермальных, так и из субэпидермальных клеток.

Возможные пути преобразования, включая органогенез, при культивировании изолированной ткани представлены на рис. 4.12.

Возможные пути преобразования при культивировании изолированных тканей
Рис. 4.12. Возможные пути преобразования при культивировании изолированных тканей

Предрасположенность клеток культивируемой ткани к определенному пути органогенеза в условиях in vitro может зависеть от многих факторов:
- таксономической принадлежности и генотипа исходного растения;
- онтогенетического возраста растения;
- локализации ткани, использованной в качестве экспланта;
- действия физических факторов при культивировании;
- длительности культивирования;
- состава питательной среды.

Рассмотрим примеры, подтверждающие эти положения.

Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений.

У двудольных растений каллусную ткань, способную к органогенезу, можно индуцировать не только из меристематических клеток, но и из вполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. Например, у злаков каллус можно получить из зародышей, гипокотиля, корневых и стеблевых апексов, сегментов молодых листьев, молодых соцветий. Возможности получения растений-регенерантов у злаков еще более ограничены. Регенерация растений происходит в основном из каллуса, индуцированного из молодых зародышей и молодых соцветий.

Роль генотипа в проявлении морфогенной способности в культуре тканей хорошо изучена на примере разных сортов, изогенных и мутантных линий табака, моркови, цветной капусты, пшеницы, риса и других растений. Выявлены соответствующие доноры с высоким морфогенным потенциалом в культуре in vitro.

Зависимость особенностей органогенеза от онтогенетического состояния растения выявлена, в частности, при изучении культивирования листовых эксплантов эчеверии (семейство Толстянковых) и табака.

Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного экспланта. Уровень эндогенных фитогормонов определяет и зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, использованной в качестве исходного экспланта.

Особенности органогенеза изучены в зависимости от таких физических факторов, как температура, содержание кислорода в культуральной системе, продолжительность и качество освещения. Результаты многих экспериментов однозначно продемонстрировали, что с увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. Гораздо дольше сохраняется способность к ризогенезу - образованию корней.

Что касается факторов питательной среды, определяющих особенности регенерации в культуре ткани, то в наибольшей степени на индукцию стеблевых почек и корней влияет фитогормональный баланс.

При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности:
1. Определенное превышение концентрации кинетина над ауксином в неорганизованно растущей каллусной культуре приводит к образованию стеблевых почек и побегов.
2. Увеличение концентрации ауксина способствует развитию корней.
3. Среднее, близкое к равному, соотношение концентраций этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани.

Процессы органогенеза на клеточном уровне могут носить продолжительный характер и быть асинхронными. В каллусной культуре образование меристематических зон происходит в основном в базальной ее части, контактирующей с питательной средой. Клетки меристематических зон характеризуются интенсивным синтезом РНК и белка и становятся источником формирующихся зачатков органов. Этот процесс контролируется экзогенными фитогормонами, содержащимися в питательной среде, и эндогенными, синтезируемыми самими клетками.



Возможность индуцирования процессов органогенеза и регенерации растений из стеблевых почек в культуре in vitro используется для массового размножения растений.

Соматический эмбриогенез

При культивировании in vitro и из клеток экспланта, и из клеток каллуса могут развиться соматические зародыши, или эмбриоиды, которые, как и стеблевые почки, при прорастании дают целые растения. В зависимости от пути образования эмбриоидов (из экспланта или каллуса) по аналогии с органогенезом различают прямой и непрямой путь соматического эмбриогенеза.

Морфологические различия между стеблевыми почками и эмбриоидами заключаются в следующем. Эмбриоиды развиваются из соматических клеток как автономные структуры. Для соматических зародышей, как и для зиготических, характерна биполярность (рис. 4.13).

Морфологические особенности зиготических (а) и соматических (в) зародышей по сравнению со стеблевыми почками, развивающимися in vivo (б) и in vitro (г)
Рис. 4.13. Морфологические особенности зиготических (а) и соматических (в) зародышей по сравнению со стеблевыми почками, развивающимися in vivo (б) и in vitro (г)

Стеблевые почки, развивающиеся и у интактных растений, и в культуре in vitro, монополярны и не автономны, так как связаны сосудистыми тканями с органом растения или каллусной тканью.

Пример соматического эмбриогенеза in vivo - адвентивная полиэмбриония у цитрусовых. В одном семени может развиваться до сорока зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Он формируется от слияния половых клеток и несет признаки материнского и отцовского растения. Остальные зародыши - неполовые, развиваются из клеток нуцеллуса, окружающего зародышевый мешок, и несут признаки только материнского растения. Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используют для их клонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitro в условиях, где происходит индукция образования эмбриоидов из отдельных клеток.

Образование структур, подобных зародышевым, впервые описал Ф. Стюард в 60-е гг. Культивирование клеток корня моркови в жидкой среде с кокосовым молоком приводило к их быстрому делению и образованию клеточных агрегатов. Внутри этих агрегатов происходила дифференцировка элементов ксилемы, после чего формировались корневые зачатки.

При переносе культуры на агаризованную среду наблюдалось образование из этих структур побегов, развивающихся в целое растение.

Источником эмбриогенного каллуса у моркови могут быть разные органы: корень, листья, стебель, зиготические зародыши.

Интересной моделью для изучения соматического эмбриогенеза является лютик - Ranunculus sceleratus. На среде, содержащей кокосовое молоко, в соматических тканях и пыльниках формируется эмбриогенный каллус.

В течение трех недель как внутри каллуса, так и на его поверхности образуются эмбриоиды, по своему строению напоминающие зиготические зародыши. Такие же эмбриоиды могут формироваться и из клеток суспензионной культуры. При пассировании соматических зародышей на свежую среду индуцируется развитие проростков, у которых по всему стеблю из отдельных эпидермальных клеток без дополнительной индукции формируются многочисленные эмбриоиды.

У злаков в условиях культивирования эмбриогенный каллус может быть получен из щитков молодых зародышей, помещенных на поверхность агаризованной среды, содержащей 2,4-Д. Соматический эмбриогенез у злаков на примере культурного ячменя был впервые описан в 1970 г. Норстогом.

Различают критические стадии в развитии и прорастании эмбриоидов, индуцированных в каллусной культуре:
1. Дедифференциация клеток экспланта. Этот период связан с активацией генов, контролирующих деление клеток. В культуральную среду необходимо вводить ауксины (например, для злаков) или ауксины в сочетании с цитокининами (для хвойных), стимулирующие как процесс дедифференциации, так и образования эмбриогенных групп клеток.

2. Развитие эмбриоидов, происходящее в зонах эмбриогенных клеток и контролируемое генами, последовательно экспрессирующимися на разных стадиях эмбриоидогенеза. На данном этапе культивирования концентрация ауксинов в питательной среде или снижается, или полностью исключается.

3. Прорастание эмбриоидов и развитие растений. В этот период требования к среде и условиям культивирования могут быть различными в зависимости от культивируемого объекта. Так, для развития растений из эмбриоидов цитрусовых в культуре нуцеллуса необходим гиббереллин, а у винограда культивирование проводят при пониженной температуре (t = 4 °С). Чтобы индуцировать прорастание соматических эмбриоидов у злаков и цикламена, необходимо использовать безгормональную среду или среду с низким содержанием ауксинов.

Возможность получения соматических зародышей у растений используют для получения искусственных семян или при клональном размножении растений.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы