Органогенез в культуре соматических тканей: суспензионные культуры

29 Декабря в 18:48 1329 0


Суспензию клеток можно получить из каллуса при помещении его в жидкую питательную среду на качалку или непосредственно из ткани экспланта с помощью пектиназы и встряхивания. Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате образуется клеточная суспензия.

Суспензионные культуры - это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100-120 об/мин.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, который легко фрагментируется на отдельные клетки или небольшие агрегаты и получается на средах с 2,4-Д. Облегчает суспендирование исключение из питательной среды ионов кальция, цитокининов или уменьшение их концентрации и увеличение ауксинов. Еще более - добавление в среду пектиназы, которая разрушает пектат кальция, склеивающий между собой отдельные клетки

Основным условием культивирования клеточных суспензий является постоянное встряхивание или перемешивание среды. Иначе опять формируется каллусная ткань! Деление поддерживается присутствием ауксинов и цитокининов, которые необходимы для индукции и роста каллусной ткани.

Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 сут. Обычно длительность культивирования составляет 14-16 дней. При этом плотность возрастает от 10 000 до 1 000 000 кл/мл. Для субкультивирования суспензия берется в конце экспоненциальной фазы, метаболиты - лучше в стационарной.

Назначение суспензий - получение вторичных метаболитов (лекарства, парфюмерия, биомасса, селекция и протопласты). Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве.

Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.

Характеристики суспензии - жизнеспособность, плотность в суспензии, степень агрегированности, скорость роста.
По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14-16 дней после начала культивирования).



При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 недели культивирования возрастает в 20 раз.

В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты.

При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы, по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности ферментов.
Жизнеспособность определяется по окрашиванию метиленовой синью или синей Эванса (0,5 %-м раствором синей Эванса или 0,01 %-м раствором флуоресцеинацетата).

Прижизненные красители клетки не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Жизнеспособность культуры определяют соотношением количества жизнеспособных клеток к общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при окрашивании препаратов красителями.

Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились.

Культивирование суспензий осуществляется в периодическом или непрерывном (проточном) режиме. Клетки не удаляются в закрытой системе, частично удаляются - в открытой. Для промышленного производства применяют ферментеры.

Во многих случаях изучение особенностей размножения и роста клеток связано с необходимостью использования синхронизированных клеточных популяций.

Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, например, пониженной температурой, или химических соединений.

Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК: тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл продолжается только до Gi-периода и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.

Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды, например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накапливаются в Gi- или Ог-периоде клеточного цикла. Затем пассирование суспензии на среду с недостающим компонентом приводит к синхронизации клеточного деления. С помощью индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотический индекс с 2-3 до 30-35 %.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы