Органогенез в культуре соматических тканей: сомаклональная изменчивость, гормоннезависимые растительные ткани

28 Декабря в 20:16 2322 0


Сомаклональная изменчивость

Морфогенез и регенерация растений в культуре соматических клеток достаточно часто сопровождается изменениями регенерантов по сравнению с растениями, введенными в культуру.

Австралийскими исследователями Ларкиным и Скоукрофтом растениярегенеранты предложено называть сомаклонами (от сома - тело), а проявление генетической изменчивости у растений, регенерировавших в результате культивирования in vitro, - сомаклональной изменчивостью. По определению Бутенко, сомаклональные варианты - фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органельного геномов растительных клеток, от истинных генных мутаций отличаются большой частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).

Сомаклоны, у которых проявляется генетическая изменчивость, относят к сомаклональным вариантам.

Приняты следующие обозначения для растений-регенерантов или, соответственно, для сомаклонов и их самоопыленных потомков:
R - растение-регенерант; R1 R2 и т. д. - первое, второе и последующие самоопыленные поколения растения-регенеранта;
SC - сомаклон; SC1, SC2 и т. д. - первое, второе и последующие самоопыленные поколения сомаклона.
Сомаклональная изменчивость характеризуется высокой частотой мутирования. По данным корпорации DNA Plant Technology (США), до 15 % регенерированных в культуре тканей растений томатов имели в потомстве генетические изменения. При исследовании числа хромосом у растенийрегенерантов различных сортов пшеницы структурные изменения хромосом обнаружены примерно у 25 % регенерировавших растений.

Сомаклональные изменения наследуются и связаны с простыми генными мутациями. Однако в настоящее время неизвестен конкретный генетический механизм, приводящий к нестабильности культивируемых клеток. В различных исследованиях обнаружены многочисленные кариологические нарушения у регенерантов - полиплоидия, анеуплоидия, фрагментирование хромосом, хромосомные мосты, транслокации, делеции, инверсии, многочисленные хромосомные аберрации.

Условия in vitro являются стрессом для культивируемых клеток и тканей. Это связано с изоляцией от целого организма его фрагментов и помещением их в новые условия.

В процессе культивирования наблюдается цитогенетическая и генетическая гетерогенность клеточных культур, что определяется:
- клеточной гетерогенностью исходных эксплантов, связанной с уровнем их полисоматии (миксоплоидии);
- условиями культивирования, где ведущая роль в индуцировании клеточной изменчивости принадлежит фитогормонам.

Вследствие этого растения, регенерировавшие в условиях in vitro из развивающихся соматических эмбриоидов или из стеблевых почек, могут характеризоваться фенотипической и генетической изменчивостью.

Так, спектр фенотипического разнообразия у растений-регенерантов более выражен, чем у их потомков, полученных после самоопыления. Это связано с физиологическими нарушениями, происходящими в процессе культивирования на искусственной питательной среде и приводящими к подавлению роста и развития растений, снижению их фертильности.

Например, у регенерантов ячменя и пшеницы можно наблюдать формирование сдвоенных колосьев, супротивно расположенных листьев. Такие нарушения, как правило, не наследуются.

На основании изучения сомаклонов выявлены следующие механизмы, которые могут объяснить сомаклональную изменчивость:
1) грубые кариологические нарушения (изменения числа хромосом -полиплоидия, анеуплоидия; хромосомные перестройки - транслокации, делеции, инверсии, дупликации), которые хорошо определяются цитологическими методами анализа;
2) хромосомные перестройки, не выявляемые при цитологическом анализе и квалифицируемые как точковые мутации;
3) соматический (митотический) кроссинговер и обмен сестринских хроматид (наиболее хорошо изучено у томатов);
4) изменчивость цитоплазматических геномов;
5) амплификация и редукция генов;
6) активация ранее репрессированных (молчащих) генов;
7) активация мобильных элементов (изучено у отдельных моделей -люцерны, табака, кукурузы).

Таким образом, под термином «сомаклональная изменчивость» понимают разнообразный спектр генетической, цитогенетической, молекулярной изменчивости, обусловленный изменениями в ядерном или цитоплазматических геномах в результате культивирования in vitro.

Выявлено несколько причин генетической нестабильности культивируемых клеток. В большинстве случаев генетической основой сомаклональной изменчивости являются мутации единичных или небольшой группы генов доминирующего или рецессивного характера в ядерном, пластидном или митохондриальном геномах. Другой причиной может являться длительное пассирование тканевых и клеточных культур, приводящее к накоплению в них генетических изменений.

Каждый из указанных выше механизмов, обусловливающих изменчивость у сомаклонов, в определенной степени связан с другими и зависит от нарушений клеточного цикла, которые индуцируются действием фитогормонов, содержащихся в культуральной среде.

Экспериментально установлены следующие закономерности:
1. Регенеранты, развившиеся в результате непрямого эмбриогенеза или органогенеза, характеризуются большей изменчивостью, чем регенеранты, полученные в результате прямого эмбриогенеза или органогенеза.
2. С длительностью культивирования частота сомаклональной изменчивости у регенировавших растений увеличивается.
3. Степень изменчивости по частоте цитогенетических нарушений у сомаклонов определяется жизнеспособностью растений.



Для выявления у сомаклонов изменений в виде точковых мутаций производят их скрещивание с исходными линиями и прослеживают расщепление в ряду поколений.

Значительная часть сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы, томатов, риса обусловлена стабильными генетическими изменениями следующего характера:
- у сомаклонов мягкой пшеницы и риса, например, выявлены изменения по биохимическим и морфологическим признакам, находящиеся под моногенным (состав глиадинов, цвет зерновок) и полигенным (высота растений, сроки колошения, урожайность) генетическим контролем;
- сомаклоны могут иметь изменения по ряду признаков, которые в потомстве группируются независимо;
- мутации у сомаклонов могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными;
- мутации, обнаруженные у сомаклонов мягкой пшеницы, могут затрагивать гены, локализованные во всех семи гомеологических группах хромосом мягкой пшеницы;
- у сомаклонов томатов обнаружены новые генные мутации, ранее не индуцированные в результате химического или радиционного мутагенеза;
- одиночные генные мутации у сомаклонов могут проявляться с относительно высокой частотой (в среднем в одном растении на каждые 20-25 растений-регенерантов).

Изменчивость митохондриального генома обнаружена у сомаклонов разных растений. Наиболее хорошо это явление изучено у растений кукурузы, регенерировавших из каллусной ткани незрелых зародышей. Анализ митохондриальной ДНК показал, что в структуре мт-ДНК сомаклонов произошли изменения, которые определяли их высокую чувствительность к грибу Helminthosporium maydis и которые не были выявлены у растений семенных поколений.

Примером изменчивости пластидного генома, вызванной его делециями, служат многочисленные данные по получению альбиносов среди сомаклонов пшеницы, риса, ячменя, сорго, кукурузы.

Амплификация (увеличение дозы гена, приводящее к возрастанию количества соответствующего фермента) описана в клетках суспензионной культуры люцерны. Была выделена клеточная линия, которую по сравнению с исходной характеризовала более высокая устойчивость к гербициду фосфинотрицину.

Таким образом, сомаклональную изменчивость можно рассматривать как один из источников увеличения генетического разнообразия растений.

Гормоннезависимые растительные ткани

Ткани, образованные «привыкшими» клетками, которые приобретают способность расти без гормонов (становятся автономными по отношению к экзогенным цитокининам и ауксинам), называются гормоннезависимыми. Еще их называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь тератомы, хотя в отдельных случаях формируются и регенеранты. В таких тканях, как и в опухолевых, наблюдается интенсивный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательную среду.

Кроме «привыкших» тканей существуют опухоли растительного происхождения, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее распространенными в природе и представляющими интерес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудомный растений агробактериями (Agrobacterium tumefaciens). Часто встречаются еще два вида истинных опухолей у растений - бородатый корень (Agrobacterium rhizogenes) и стеблевой галл (Agrobacterium rubi), сходный с корончатым галлом.

Общим свойством химических и природных опухолей растений является их гормоннезависимость. Внешне и те, и другие ткани сходны с каллусными. У «привыкших» тканей гормоннезависмость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, следовательно, в конечном счете отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае носят эпигенный характер, хотя нельзя исключить и возможность мутации.

В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.

В 40-х гг. Браун показал, что ткани корончато-галловой опухоли даже в отсутствие агробактерий (например, после гибели под воздействием высоких температур) сохраняют опухолевые свойства. На искусственной среде эти ткани продолжают активно пролиферировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов.

В 1977 г. Чилтон показал, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фрагмента Ти-плазмиды (Т-ДНК) агробактерий в растительную ядерную ДНК. Таким образом, сегмент Типлазмиды интегрируется в хромосому и становится частью наследственного аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки.

Гормоннезависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации клеток. Путь синтеза этих гормонов в опухолевых клетках более простой и короткий, чем в нормальных и «привыкших» клетках.

Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез галлами нового класса веществ, не встречающихся в природе, - опинов. Они содержатся только в тканях корончатых галлов и служат их маркерами. Они являются ростовыми веществами агробактерий, однако опухоли продуцируют их и в отсутствие микроорганизмов.

Общие свойства «привыкших» и опухолевых клеток: гормоннезависимость и отсутствие регенерации.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы