Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии

26 Декабря в 10:01 1612 0


Трансгенные, или генетически модифицированные, организмы (ГМО) -это организмы, постоянный генетический материал которых был изменен методами генной инженерии. Эти методы широко известны, так же как технологии рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование. При использовании данных технологий молекулы ДНК из различных источников комбинируют в одну молекулу, образуя новый генный комплекс.

Такая новая молекула называется рекомбинантной ДНК. Внедрение различными методами рекомбинантной ДНК в живой организм превращает его в генетически модифицированный. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Такая генетическая модификация, проводимая, как правило, в научных или хозяйственных целях для получения желаемых качеств изменяемого организма, отличается целенаправленным изменением генотипа организма, в отличие от случайных изменений, характерных для естественного и искусственного мутагенеза.

Следует отметить, что, как в любой новой области науки, в молекулярной биотехнологии в настоящее время существует некоторая терминологическая неопределенность. Так, если внедрение рекомбинантной ДНК происходит в хромосому, такой организм, как правило, называют трансгенным. Организмы, несущие рекомбинантную ДНК на внехромосомных элементах, например плазмидах, определяются как рекомбинантные. В то же время некоторые авторы не проводят различий между трансгенными и рекомбинантными организмами, а многие просто используют более общий термин «генетически модифицированные организмы».

Возможность конструировать новые гибридные молекулы ДНК in vitro возникла благодаря сделанным в середине XX в. открытиям, таким как установление комплементарной структуры ДНК, механизма ее репликации и репарации, расшифровка генетического кода, установление механизма переноса генетической информации в клетке, механизмов работы и регуляция генов и др.

Одним из наиболее значительных открытий, которые позволили развить генно-инженерные технологии, было идентификация и выделение рестрикцион-ных эндонуклеаз, осуществляющих сайт-специфическое расщепление ДНК. До этого открытия не существовало воспроизводимого метода фрагментации ДНК.

Открытие ряда ферментов нуклеинового обмена: ДНК-лигазы, различные ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы (ревертазы), фосфатазы, полинуклеотидкиназы и другие - позволило получить инструменты для проведения различных манипуляций с фрагментами ДНК in vitro. Автоматический синтез олигонуклеотидов - коротких одноцепочечных ДНК (~10-40 оснований), используемых в основном как затравки (праймеры) для ДНК-полимераз, и разработка метода полимеразной цепной реакции существенно упростили все, сделав возможным клонирование и размножение молекул ДНК в пробирке. Другим важнейшим шагом для молекулярного клонирования было развитие методов секвенирования - быстрого определения нуклеотидной последовательности.

Основы генной инженерии были заложены в 1972-1973 гг., когда П. Берг (P. Berg) получил первые рекомбинантные ДНК, а С. Коэн (S. Cohen) и Г. Бойер (H. Boyer) разработали стратегию переноса функционально активных гибридных молекул ДНК в бактериальную клетку. Таким образом, был впервые осуществлен перенос функциональной единицы наследственности из одного организма в другой и перед человечеством возникли ошеломляющие перспективы конструирования новых форм жизни с полезными функциями.

Однако одним из первых откликов научного мира на создание новой технологии был запрет на некоторые биотехнологические эксперименты, считавшиеся потенциально опасными. Преобладали опасения, что при конструировании рекомбинантных ДНК случайно возможно создание организма с опасными свойствами. Группа видных ученых провела в 1975 г. знаменитую Асиломарскую конференцию по рекомбинантным молекулам ДНК для того, чтобы определить, как действовать безопасно. Впоследствии, с принятием инструкций по обеспечению безопасности генно-инженерных работ, многие ограничения были сняты, но до сих пор дискуссии о потенциальной опасности генетически модифицированных организмов остаются в центре внимания общества.

Также возникает ряд тревожных вопросов о применении современных технологий для создания биологического оружия. Например, сегодня ученые способны синтезировать любые последовательности ДНК. Возникает вопрос: смогут ли террористы воссоздавать вирусы, подобные оспе, или конструировать вирусы даже более смертоносные, чем птичий грипп и геморрагическая лихорадка Эбола? Поэтому в настоящее время многие с пониманием относятся к необходимости надлежащего контроля исследований в области биотехнологий.


Рестриктазы и другие ферменты для молекулярного клонирования

Инструментами в технологии рекомбинантных ДНК являются ферменты нуклеинового обмена и, прежде всего, эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Конструирование рекомбинантных ДНК стало возможным только после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи в определенном месте. Эти ферменты называются эндонуклеазами рестрикции (рестриктазы) II типа. Существует всего три типа эндонуклеаз рестрикции, но другие два не нашли широкого применения, поскольку не обладают необходимой специфичностью при расщеплении ДНК.

В природе рестриктазы являются компонентом системы рестрикции-модификации (Р-М-системы), которая служит защитным механизмом от чужеродной ДНК у микроорганизмов, например при вирусной (фаговой) инфекции. В Р-М-систему входят два фермента, специфичных для каждого штамма, - ДНК модифицирующий (метилтрансфераза, или метилаза) и ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции), иногда обе эти функции объединены в одном белке.

Эти два фермента способны специфически связываться с одной и той же последовательностью ДНК длиной 4-8 пар оснований, называемой сайтом узнавания и характерной для каждого конкретного микроорганизма. При этом метилтрансфераза, метилируя определенный нуклеотид в пределах сайта узнавания, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы. В свою очередь, рестриктаза расщепляет фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК в определенном месте участка узнавания или рядом с ним при отсутствии специфической модификации.

В настоящее время охарактеризована субстратная специфичность около 3,5 тыс. рестриктаз, из них имеется 238 (прототипы), узнающих уникальные нуклеотидные последовательности. Рестриктазы, узнающие одинаковые участки ДНК, составляют группу изошизомеров и могут отличаться по свойствам, в том числе по-разному расщеплять двухцепочечную ДНК. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющиеся палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК, рис. 2.1).

Нуклеотидная последовательность, содержащая сайты расщепления для различных рестриктаз до и после обработки рестриктазами
Рис. 2.1. Нуклеотидная последовательность, содержащая сайты расщепления для различных рестриктаз до и после обработки рестриктазами. Для рестриктазы Sfi I последовательность из 5 нуклеотидных пар между узнаваемыми фрагментами может быть любой, но расщепляется всегда одинаково с образованием 5'-выступающих концов

Различные рестриктазы образуют различную форму концов при расщеплении ДНК, которые могут быть 5'-выступающими одноцепочечными (рис. 2.1, EcoR I, Sfi I), З'-выступающими (Pst I) или полностью двухцепочечными - «тупыми» (Sma I). Выступающие одноцепочечные концы, если они комплементарны, получили название «липких», поскольку такие концы могут гибридизоваться. Молекулы ДНК из разных источников, обработанные одной и той же рестриктазой, расщепляющей палиндромные последовательности (например, EcoR I и Pst I), будут иметь одинаковые гибридизующиеся между собой липкие концы.

Наличие липких концов у фрагментов ДНК существенно облегчает их ковалентное сшивание специальным ферментом ДНК-лигазой (см. схему на рис. 2.3), который формирует фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами через 5'-фосфатную и 3'-гидроксильную группы. Сам процесс называется лигированием. ДНК-лигаза в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

Кроме молекулярного клонирования и физического картирования молекул ДНК (для создания рестрикционных карт ДНК), эндонуклеазы рестрикции также широко применяются в медицинской генодиагностике для выявления различных мутаций и в генетических популяционных исследованиях.

Другими группами ферментов, используемых при конструировании рекомбинантных ДНК, являются ферменты матричного синтеза - ДНК- и РНК-зависимые ДНК-полимеразы и ферменты, позволяющие осуществить нужные изменения структуры концов ДНК-фрагментов: полинуклеотидкиназы, фосфатазы, нуклеазы и другие ферменты для различных манипуляций с фрагментами ДНК.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы