Общая схема вектора на примере бактериальной экспрессионной плазмиды

26 Декабря в 10:23 2261 0


Определяющим в выборе вектора для молекулярного клонирования является поставленная цель и предполагаемый организм-хозяин. Даже если в качестве окончательного хозяина рекомбинантной ДНК планируется совсем другой организм, генетические конструкции собирают, мутируют и нарабатывают, как правило, в E.coli с использованием специализированных бактериальных векторов, затем субклонируют в вектор для окончательного хозяина. Иногда удобно использовать челночный, или шаттл-вектор (shuttle vector), с двумя сайтами инициации (ориджинами) репликации, способный реплицироваться в обоих хозяевах, ориджины которых он содержит. Несмотря на все имеющееся разнообразие векторов, большинство укладывается в общую схему бактериального клонирующего вектора (рис. 2.7).

Общая схема типичного экспрессионного бактериального вектора
Рис. 2.7. Общая схема типичного экспрессионного бактериального вектора. Экспрессионная кассета изображена в увеличенном масштабе. МКС - множественный клонирующий сайт, RBS (ribosome binding site) или последовательность Шайн-Дальгарно (SD) - сайт связывания рибосом, обеспечивает связывание прокариотической рибосомы за счет комплементарности З'-концевой части 16S рибосомальной рРНК с матричной мРНК

Определяющим в выборе вектора для молекулярного клонирования является поставленная цель и предполагаемый организм-хозяин. Даже если в качестве окончательного хозяина рекомбинантной ДНК планируется совсем другой организм, генетические конструкции собирают, мутируют и нарабатывают, как правило, в E.coli с использованием специализированных бактериальных векторов, затем субклонируют в вектор для окончательного хозяина. Иногда удобно использовать челночный, или шаттл-вектор (shuttle vector), с двумя сайтами инициации (ориджинами) репликации, способный реплицироваться в обоих хозяевах, ориджины которых он содержит.

Несмотря на все имеющееся разнообразие векторов, большинство укладывается в общую схему бактериального клонирующего вектора (рис. 2.7). Вектор, содержащий необходимые элементы для трансляции клонируемой ДНК (экспрессионная кассета с сигналами транскрипции и трансляции, часто репрессор промотора), называется экспрессионным.

Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит следующие элементы.
1. Сайт инициации репликации (ориджин) - необходимый элемент, то, что делает молекулу ДНК вектором и определяет его хозяйскую специфичность. Структура ориджина репликации обуславливает копийность вектора - количество молекул на клетку (1-4 для низкокопийных, 15-20 для обычных и 150-200 и более для высокопийных векторов), а также его совместимость с другими векторами. В одной клетке могут сосуществовать только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости. Включение в вектор ориджина репликации одноцепочечного фага f1 позволяет получить всю конструкцию в виде одной цепи ДНК, например, для мутагенеза.

2. Селективный ген, предназначенный для отличия содержащих рекомбинантную конструкцию клеток (трансформированных) от исходных. Чаще всего используют гены устойчивости к различным антибиотикам, например, популярен ген ввтактамазы, придающий устойчивость к ампициллину.

3. Множественный клонирующий сайт (МКС, MCS), состоящий из близкорасположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (единственных в данном векторе) для удобства соединения с клонируемой. Иногда его называют полилинкер. В экспрессионную кассету ген вставляется с сохранением имеющейся рамки считывания или с собственным стартовым кодоном (AUG) на определенном расстоянии от рибосомсвязывающего сайта (RBS).

Вектор, содержащий необходимые элементы для трансляции клонируемой ДНК (экспрессионная кассета с сигналами транскрипции и трансляции, часто репрессор промотора), называется экспрессионным.

Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит следующие элементы.
1. Сайт инициации репликации (ориджин) - необходимый элемент, то, что делает молекулу ДНК вектором и определяет его хозяйскую специфичность. Структура ориджина репликации обуславливает копийность вектора - количество молекул на клетку (1-4 для низкокопийных, 15-20 для обычных и 150-200 и более для высокопийных векторов), а также его совместимость с другими векторами. В одной клетке могут сосуществовать только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости. Включение в вектор ориджина репликации одноцепочечного фага f1 позволяет получить всю конструкцию в виде одной цепи ДНК, например, для мутагенеза.

2. Селективный ген, предназначенный для отличия содержащих рекомбинантную конструкцию клеток (трансформированных) от исходных. Чаще всего используют гены устойчивости к различным антибиотикам, например, популярен ген ввтактамазы, придающий устойчивость к ампициллину.

3. Множественный клонирующий сайт (МКС, MCS), состоящий из близкорасположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (единственных в данном векторе) для удобства соединения с клонируемой. Иногда его называют полилинкер. В экспрессионную кассету ген вставляется с сохранением имеющейся рамки считывания или с собственным стартовым кодоном (AUG) на определенном расстоянии от рибосомсвязывающего сайта (RBS).



4. Сигнальные и регуляторные элементы экспрессии (транскрипции с последующим синтезом белка), хорошо работающие в клетке-мишени и необходимые для экспрессии клонированного гена. Прокариотические и эукариотические сигнальные и регуляторные элементы сильно различаются, но среди прокариотических, так же как и среди эукариотических, существуют универсальные элементы, хорошо работающие в широком круге хозяев, и специфические, работающие только в конкретной клетке.

Составной частью любого экспрессионного вектора является экспрессионная кассета (рис. 2.7), которая включает все необходимые сигнальные и регуляторные элементы, позиционированные относительно клонируемого в МКС гена. Для бактерий это промотор, обычно строго регулируемый, регуляторные элементов транскрипции и трансляции (в том числе энхансеры и структуры, стабилизирующие мРНК), сайт связывания рибосом, терминаторы трансляции и транскрипции.

Использование сильных промоторов и регуляторных элементов позволяет достигать высоких уровней экспрессии целевого продукта. Для E. coli традиционно популярны лактозный lac и триптофановый trp промоторы и их гибрид tac. Одни из самых сильных промоторов, терминаторов и других регуляторных элементов - вирусные - широко

5. Ген-репрессор транскрипции с векторного индуцибельного промотора, часто вводимый в состав векторов для более сильного ингибирования синтеза целевого белка в отсутствие индукции. Особенно это актуально при клонировании токсичных для клетки-хозяина белков. Наличие в составе вектора гена-репрессора транскрипции позволяет строже регулировать синтез клонированной ДНК и не зависеть от клеточной регуляторной системы.

6. Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде фьюжинов. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различные эпитопы, при этом целевой белок синтезируется в виде N- или C-концевого фьюжина (гибридного белка). Цели могут быть различными - повышение уровня экспрессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие эпитопы (таги) вводят для аффинной очистки синтезируемого белка.

Например, наличие полигистидиновой последовательности (His-tag) из 6 или 10 аминокислотных остатков позволяет проводить очистку рекомбинантного белка аффинной хроматографией с использованием иммобилизованных на твердом носителе ионов металлов (Co2+, Ni2+), фрагмент глутатион-S-трансферазы может быть использован для очистки на смоле, содержащей связанный глутатион. Как правило, присоединяют такие белковые фрагменты через последовательности, содержащие сайты расщепления специфических протеаз. В этом случае после очистки рекомбинантного белка лишние последовательности можно удалить протеазной обработкой.

7. Редкие кодоны в составе чужеродного гена, приводящие к снижению скорости его трансляции. Только аминокислота триптофан кодируется всего одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, -по крайней мере, двумя, чаще четырьмя, а иногда и шестью кодонами (лейцин, серин, аргинин). При этом живые организмы используют синонимичные си-кодоны для кодирования белков статистически не пропорционально.

Из четырех кодонов для глицина GGA используется в структурных генах человека в 26 % случаев, а в Escherichia coli - в 9 %. Такая же ситуация наблюдается и для стоп-кодонов. Так, у человека частота использования кодонов UAA, UAG и UGA составляет 0,22, 0,17 и 0,61 соответственно, а у E. coli — 0,62, 0,09 и 0,30. Для каждого типа организмов существует своя предпочтительная частота использования кодонов (codon usage) и, соответственно, свой концентрационный набор изоакцепторных транспортных тРНК.

Таким образом, при гетерологичной экспрессии плохая трансляция целевого гена, имеющего в своем составе редкие для клетки-мишени кодоны, может происходить вследствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК,   узнающей   такие   кодоны.   Проблему   можно   решить химикоферментативным синтезом целевого гена с соответствующей организму-рецепиенту частотой использования кодонов (оптимизация гена).

В случае экспрессии в E. coli сконструированы специальные экспрессионные штаммы, компенсирующие использование редких кодонов введением дополнительных генов для дефицитных тРНК. Например, популярная серия штаммов E. coli BL21-CodonPlus (ее вариант RIL) содержит дополнительные копии генов, дефицитных для E. coli тРНК, узнающих аргининовые кодоны AGA и AGG, изолейциновый кодон AUA и лейциновый кодон CUA, для эффективной трансляции генов из организмов, имеющих АТ-богатые геномы.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы