Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

04 Января в 7:45 3048 0


Традиционная биотехнология зародилась десять-двенадцать тысяч лет назад, когда закончилось последнее оледенение. Веками человек использовал микроорганизмы для выпечки хлеба, приготовления пива, сыра, выращивания сои, производства вина, витаминов. Интерес к производству пищевых продуктов не ослабевает и в наше время, но эти производства перешли на новый уровень с использованием всех новейших достижений современной биологии.

Разрабатываются биотехнологии получения экологически чистой пищи для обеспечения сбалансированного питания как на основе высших растений, так и с помощью микробиологического синтеза.

Продукты биотехнологического производства

Продукты биотехнологии являются результатом функционирования биологических систем для технических и промышленных процессов. Сюда относятся как традиционные организмы, так и организмы, явившиеся результатом генной инженерии.

Растения являются наиболее дешевым продуцентом белков и других продуктов питания. Стоимость белка, полученного путем сельскохозяйственного культивирования сои или кукурузы, составляет менее 1 дол./кг. В то время как использование в настоящее время микробных клеток в закрытых системах (ферментерах) и особенно культивируемых клеток животных в качестве продуцентов фармацевтических белков обходится в сотни и тысячи раз дороже. Поэтому исследования последних лет имели целью, с одной стороны, показать возможность получения биологически эквивалентных форм того или иного белка в трансгенных растениях, а с другой, - повысить содержание белка и облегчить и удешевить его последующую очистку.

К настоящему времени уже показано, что растения могут производить белки животного происхождения, такие как энкефалин, моноклональные антитела, специфичные для бактерий, вызывающих зубной кариес. Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту.

Из других белков животного происхождения, которые представляют интерес для медицины, показана продукция в растениях человеческого в-интерферона. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы В-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины против такого заболевания, как холера. Причем в случае холеры иммунизация вполне эффективно происходит при пероральном приеме вакцины.

Генетическая инженерия метаболизма растительных жиров уже привела к новым коммерческим продуктам. Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты - основной компонент растительного масла. В 1995 г. была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45 % 12-членной жирной кислоты - лауриновой. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики.

Дальнейшее изучение специфики биохимического синтеза жирных кислот, по-видимому, приведет к возможности управлять этим синтезом с целью получения жирных кислот различной длины и различной степени насыщения, что позволит значительно изменить производство детергентов, косметики, кондитерских изделий, затвердителей, смазочных материалов, лекарств, полимеров, дизельного топлива и многого другого, что связано с использованием углеводородного сырья.

Однако одной из бурно развивающихся отраслей биотехнологии считается технология микробного синтеза ценных для человека веществ. По прогнозам, дальнейшее развитие этой отрасли повлечет за собой перераспределение ролей растениеводства и животноводства, с одной стороны, и микробного синтеза, с другой, в формировании продовольственной базы человечества.

Львиную долю продуктов, созданных на основе современных биотехнологий (генетической инженерии), составили фармацевтические белки, прежде всего инсулин, альфа-интерферон, антиген вируса гепатита В, эритропоэтин, фактор стимулирования гранулоцитов и многие другие вещества. В этих молекулах заключена такая мощь, что у множества разнообразных заболеваний, еще пять лет назад бывших неизлечимыми, появляется совершенно иной прогноз.

Например, достигнут существенный прогресс в борьбе с раком и возрастной слепотой - заболеваниями прежде неизлечимыми. Несколько лет назад в стадии клинических испытаний находилось менее 10 противораковых препаратов, большинство из которых представляли собой высокотоксичные средства химиотерапии. Сегодня испытания с участием людей проходят более 400 противораковых лекарств, и почти все они - целевого действия, на основе биотехнологий и с минимальными побочными эффектами.

На основе биотехнологий создано 230 лекарственных препаратов и сопутствующих продуктов, включая лекарства от бессонницы, множественного склероза, острой боли, хронической болезни почек, недержания, язв полости рта и рака.

Ни для одного раздела медицины биотехнология не сделала так много, как для онкологии. С появлением новых лекарств, которые уничтожают только клетки опухоли, почти не повреждая здоровые ткани, изменилась вся парадигма лечения рака.

Теперь медицина рассматривает рак как хроническое, поддающееся лечению заболевание. Только в 2004 г. FDA одобрила четыре целевых препарата против рака - Avastin, Tarceva, Iressa и Erbitux. Применение Avastin от компании Genentech позволяет продлить жизнь пациентов с раком легких, груди и кишечника - первейшая задача для всякого препарата от рака.

Создано и выпущено на рынок множество новых биотехнологических продуктов, повышающих урожайность сельскохозяйственных культур и продуктивность сельскохозяйственных животных.

Продуктами биотехнологии являются возобновляемые источники энергии - различные виды биотоплива. Налажено производство этанола из сырья, содержащего сахарозу, глюкозу, фруктозу, другие моно- или олигосахариды, крахмал или целлюлозу, с помощью дрожжей или бактерий. В настоящее время этанол все в большей мере применяется в качестве экологически чистого моторного топлива. Поставлено производство бутанола и ацетона с использованием бактерий-бродильщиков рода Clostridia. Технология производство водорода испытана пока только в масштабе лаборатории.



Получение метана, или биогаза, осуществляемое смешанной микробной культурой, устраняет отходы, угрожающие планете, и производит ценное газообразное топливо, заменитель природного газа. Перспективно производство длинноцепочечных углеводородов (бионефти) из биомассы углеводородсинтезирующих одноклеточных водорослей. Эти водоросли могут быть выращены в биореакторе в виде чистой культуры. Их можно также культивировать в составе природных экосистем в озерах, прудах или лагунах.

Продолжают развиваться процессы получения традиционных биотехнологических продуктов, к которым можно отнести антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений, ферменты, аминокислоты, витамины и т.д. Молекулы антибиотиков очень разнообразны по составу и механизму действия на микробную клетку. При этом в связи с возникновением устойчивости патогенных микроорганизмов к старым антибиотикам постоянно существует потребность в новых. В некоторых случаях природные микробные антибиотические продукты химическим или энзиматическим путем могут быть превращены в так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие более высокими терапевтическими свойствами.

Микроорганизмы способны осуществлять реакции трансформации, в которых те или другие соединения превращаются в новые продукты. Условия протекания этих реакций мягкие, и во многих случаях микробиологические трансформации предпочтительнее химических. Пример существующих крупномасштабных промышленных биоконверсий - производство уксуса из этанола, глюконовой кислоты из глюкозы. Широко используется микробная модификация стероидов, которые являются сложными полициклическими липидами. Теперь с использованием биоконверсии получают кортизон, гидрокортизон, преднизолон и целый ряд других стероидов, что в сотни раз снижает себестоимость производства стероидов.

Пока получение ферментов с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки продуцируют более 2 тысяч ферментов, катализирующих биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть выделены и проявляют свою активность независимо от клетки. В мире производится около 20 ферментов в объеме 65 тыс. т (а существует, как предполагают 25 000 ферментов).

Например, промышленным способом производят такие ферменты, как амилаза, глюкоамилаза, протеаза, инвертаза, пектиназа, каталаза, стрептокиназа, целлюлаза, липаза, целлюлаза, оксидаза и др. Использование иммобилизованной глюкозоизомеразы для непрерывного получения глюкозы является наиболее крупным процессом такого рода в мире.

Микробные ферменты активно используют в клинической диагностике при определении уровня холестерина в крови и мочевой кислоты. Ферменты предлагают использовать для очистки канализационных и водопроводных труб и во многих других сферах человеческой деятельности. Ферменты для медицинских или аналитических целей должны быть высокоочищенными.

Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов. Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза. За рубежом 60 % мощностей по производству аминокислот занимает глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получают в промышленном масштабе - итаконовая, молочная, уксусная, лимонная.

Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако рибофлавин (В2), витамин В12 и аскорбиновую кислоту получают микробиологическим путем. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes. Микроорганизмы являются также ценным источником получения никотиновой кислоты (витамин РР).

Микроорганизмы являются источником получения липидов специального назначения с заранее определенными свойствами. Микробные жиры заменяют растительные (а в ряде случаев и превосходят) и могут использоваться в разных отраслях промышленности, сельского хозяйства, медицине.

Микроорганизмы являются важным источником получения полимерных материалов на основе полисахаридов. Ценным микробным полисахаридом является декстран, образуемый бактериями рода Leucomonstoc. Декстран служит основой получения медицинских препаратов (кровезаменителей) и препаратов для биохимических исследований - сефадексов и других молекулярных сит. Одним из перспективных биодеградируемых полимеров, синтезируемых бактериями, являются полигидроксиалканоаты. Область использования этого класса полимеров широка - от сельского хозяйства до медицины.

С молекулярной биотехнологией человечество связывают самые большие надежды и по возможности точной диагностики, профилактики и лечения множества инфекционных и генетических заболеваний, и по значительному повышению урожайности сельскохозяйственных культур, и по многим другим до сих пор нерешенным проблемам.

К сожалению, львиную долю стоимости производства зачастую составляет не наращивание биомассы, а последующие процессы выделения и очистки продукта. Стоимость очистки тем выше, чем ниже концентрация вещества в клетках. Это особенно важно в случае фармацевтических препаратов, требующих высокой степени чистоты.

В данной главе будет рассматриваться последняя стадия получения целевого продукта - его выделение. Эта стадия существенно различается в зависимости от локализации продукта и его химической природы. Если продукт находится в культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, поэтому необходимо использовать методы, позволяющие провести разделение, например, тот или иной вид хроматографии.

Если целевой продукт локализуется в клетке, то необходимо использовать более сложный подход к его извлечению из клетки.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы