Методы тонкой очистки и разделения препаратов

04 Января в 8:03 1415 0


Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами. Наибольшее распространение получила хроматография. Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos - цвет, краска и -графия) - физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

По технике выполнения хроматографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ проводится в специальных колонках, и плоскостную: тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сорбента, в бумажной - на специальной бумаге.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10-20 мкг вещества с точностью до 5-7 %. В зависимости от природы подвижной фазы (ПФ), тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки, выпускаемые промышленностью, размером 5х15 или 20х20 см.

На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3-5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пестицидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов - водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно около 10 см) и высушивают.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине после разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения.

В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люминофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде темных пятен. Вещества, имеющие собственную флуоресценцию, также обнаруживают в УФ-свете (например, пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью стандартных веществ (свидетелей). Величина Rf рассчитывается из экспериментальных данных по уравнению
Rf = а/б, (6.1)
где а - расстояние от стартовой линии до центра пятна; б - расстояние, пройденное за это же время растворителем.
При стандартных условиях величина Rf является постоянной величиной, характерной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводимость значений Rf.

На величину Rf влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. Поэтому наряду с величиной Rf идентификацию проводят по «свидетелю». Стандартное вещество (свидетель), наличие которого предполагают в анализируемой смеси, наносят на линию стандарта рядом с исследуемой пробой. Таким образом, стандартное вещество хроматографируется в тех же условиях.

После хроматографирования и детекции пятен сравнивают величины Rf определяемого вещества и «свидетеля». Количественное определение в ТХС может быть проведено непосредственно на пластинке или после удаления веществ с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным способом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.



Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получения хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность.

ТСХ липидов музейного штамма Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252 (слева) и изолята Botryococcus озера Шира (справа)
Рис. 6.1. ТСХ липидов музейного штамма Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252 (слева) и изолята Botryococcus озера Шира (справа). Система растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85:15:1 по объему). С - стандарт, 0 - начало роста, I - 6 суток, II -13 суток, III - 24 сутки, IV - 38 сутки. 1 - полярные липиды, 2 - диациглицерины, 3 - стерины, 4 - свободные жирные кислоты, 6 - триацилглицерины, 7 - МЭЖК в стандарте, 8 - эфиры стеринов, 9 - углеводороды, X и Х1 - неидентифицированные фракции

Хроматография на бумаге. По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную, осадочную и другие виды бумажной хроматографии (БХ). В распределительной жидкость-жидкостной хроматографии бумага, приготовленная из специальных сортов хлопка, выполняет роль носителя неподвижной жидкой фазы (НФ), в качестве которой часто выступает вода, адсорбированная парами бумаги. В таком случае гидрофильная бумага используется для нормально-фазовой хроматографии.

Растворителями - подвижной фазой (ПФ) - являются спирты (метанол, этанол, н-пропанол, бутанол), простые эфиры (этиловый, метиловый), кетоны (ацетон, ацетил-ацетон), эфиры органических кислот (метилацетат, этилацетат), пиридин, хлороформ. Чаще используются смеси растворителей. Для разделения некоторых органических веществ используют метод обращенных фаз.

В этом методе для придания бумаге гидрофобного характера ее импрегнируют (пропитывают) нафталином, парафином, раствором каучука, силиконом и др. Такая бумага служит носителем для неполярных растворителей в качестве НФ. В качестве ПФ применяют смеси кислот с низшими спиртами. Обращенно-фазовая бумажная хроматография используется, например, для разделения и идентификации полиненасыщенных жирных кислот при изучении состава липидов, выделенных из животных и растительных тканей.

Бумагу пропитывают 5 %-м раствором силикона, в качестве ПФ используют 85 %-й раствор уксусной кислоты. Разделение веществ в распределительной БХ осуществляется благодаря различию в скоростях движения компонентов при многократном повторении актов экстракции и сорбции. Скорость перемещения компонентов зависит от их коэффициентов распределения (как и в методе экстракции).

По направлению движения элюента (ПФ) различают восходящую, нисходящую и радиальную (круговую) хроматографию. Если элюент движется по бумаге вверх, метод называют восходящей бумажной хроматографией; при его движении сверху вниз - нисходящей бумажной хроматографией. Очень быстро можно осуществить хроматографический анализ методом радиальной бумажной хроматографии, в котором используется бумажный круг с фитилем, опущенным в элюент.

Иногда при сложном составе пробы не удается разделить ее компоненты с помощью одного растворителя. Тогда применяют двумерную хроматографию. В угол квадратного листа хроматографической бумаги наносят раствор пробы и хроматографируют сначала в одном элюенте, затем, повернув хроматограмму на 90 град, - в другом. Первый элюент производит предварительное разделение компонентов пробы, второй - окончательное.

Для проведения хроматографии на бумаге используют стеклянные герметизированные камеры. Внутри камеры в верхней (нисходящий вариант) или нижней ее части (восходящий вариант) помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Радиальную хроматографию можно осуществить в чашке Петри. Детекцию зон, идентификацию и количественное определение в БХ проводят так же, как и в методе тонкослойной хроматографии.

Методом распределительной жидкостной бумажной хроматографии успешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, пептидов, пестицидов, фенолов, красителей, синтетических поверхностно-активных веществ.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы