Методы диагностики, основанные на ДНК-гибридизации

27 Декабря в 20:26 2216 0


Иммуноанализ имеет свои ограничения: в случае диагностирования инфекционного заболевания с помощью него невозможно различить антитела индуцированные в результате прививки и в ответ на инфицирование; если речь идет об особо опасных инфекциях, когда антитела не успевают образоваться или не образуются вовсе; если поражается иммунная система (СПИД); иногда он не в состоянии обеспечить необходимую чувствительность и т.д.

Незаменимыми и весьма эффективными в таких случаях являются методы, основанные на детекции определенных нуклеотидных последовательностей, - ДНК-гибридизационный анализ. Инфекционные агенты (бактерии, вирусы и пр. ) представляют собой живые организмы, их информация заключена в генетическом материале. Фрагмент ДНК, детерминирующий данный биологический объект, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.

Процедура любого гибридизационного анализа состоит в следующем:
1) иммобилизация одноцепочечной ДНК-мишени на твердой подложке (мембранный фильтр, поверхность планшета и т.п.);
2) спаривание меченной комплементарной последовательности (ДНК-зондом) с ДНК-мишенью при определенных условиях (температуре и ионной силе);
3) удаление несвязавшегося ДНК-зонда;
4) детекция гибридных молекул зонд-мишень.

Таким образом, в процедуре ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции полученных гибридов (рис. 3.8). Специфичность анализа определяется ДНК-зондами, а чувствительность - методами детекции. В зависимости от ситуации используют зонды различной длины (20-100 нуклеотидов). Они представляют собой продукты химического синтеза или клонирования.

Один из вариантов проведения ДНК-гибридизационного анализа. В качестве метки используют изотопы, специфические гаптены,  последовательности ДНК, белки
Рис. 3.8. Один из вариантов проведения ДНК-гибридизационного анализа. В качестве метки используют изотопы, специфические гаптены,  последовательности ДНК, белки

Для получения зондов клонированием проводят следующие процедуры: 1) расщепляют ДНК патогенного микроорганизма эндонуклеазой и клонируют в плазмидном векторе; 2) проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов; 3) плазмиды, гибидизующиеся только с ДНК патогенного штамма, используют для получения видоспецифичных зондов. Эти зонды дополнительно проверяют на отсутствие перекрестной гибридизации с ДНК из различных организмов и на модельных образцах для определения чувствительности метода.

Химический синтез олигонуклеотидов еще 20 лет назад представлял собой сложную экспериментальную задачу, связанную с большими затратами времени и реактивов, поэтому олигонуклеотиды были достаточно дороги. В настоящее время получение олигонуклеотидов осуществляется с помощью автоматических синтезаторов, и исследователь должен только правильно определить, какая именно нуклеотидная последовательность необходима для решения поставленной задачи.

Во всех синтезаторах синтез осуществляется твердофазным методом, т.е. первый нуклеозид иммобилизован на поверхности нерастворимых полимерных частиц, а растущая цепочка экспонирована к реакционной смеси, в которой находятся все необходимые реагенты. Частицы упакованы в колоночных реакторах, через которые последовательно прокачиваются растворы веществ, обеспечивающих протекание процессов синтеза.

С целью создания оптимальных гидродинамических параметров колонки частицы имеют сферическую форму и одинаковые размеры. Ключевыми мономерами для синтеза являются четыре производных нуклеозид-фосфорамидита (рис. 3.9), в которых все функциональные группы заблокированы защитными группами. 5'-гидроксильная группа каждого мономера защищена диметокситритильной группировкой (DMTr), которая легко удаляется при кислотной обработке, например, трихлоруксусной кислотой (ТХУ). По 3'-положению находится метилированная фосфитамидная группа.

Мономеры для твердофазного фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов (синтоны)
Рис. 3.9. Мономеры для твердофазного фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов (синтоны)

Экзоцикличные аминогруппы, находящиеся в составе гетероциклических оснований В (гуанина, аденина и цитидина) заблокированы группировками (ацильные остатки), которые удаляются в щелочных условиях по окончании синтеза. Такие мономеры называются синтонами.

Схема химического синтеза олигонуклеотидов приведена на рис. 3.10.

Схема химического синтеза олигонуклеотидов: Р - нерастворимый полимер или стекло - частицы, на поверхности которых фиксированы первые нуклеотиды и растущая олигонуклеотидная цепь; В1, В2... - нуклеотидные основания; DMTr - диметок-ситритил
Рис.3.10. Схема химического синтеза олигонуклеотидов: Р - нерастворимый полимер или стекло - частицы, на поверхности которых фиксированы первые нуклеотиды и растущая олигонуклеотидная цепь; В1, В2... - нуклеотидные основания; DMTr - диметок-ситритил

Рассмотрим несколько примеров проведения гибридизационного анализа (рис. 3.11). На неподвижной матрице в качестве зонда иммобилизовали 20-звенный олигонуклеотид 3I, комплементарный участку ДНК вируса гепатита С. В качестве неподвижной фазы использовали поверхности планшетов или полимерных частиц. Иммобилизацию проводили с помощью ковалентной пришивки.

Схема проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Для выявления гибридов использовали конъюгаты репортерного белка с авидином или стрептавидином
Рис. 3.11. Схема проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Для выявления гибридов использовали конъюгаты репортерного белка с авидином или стрептавидином

В качестве ДНК-матрицы использовали синтетический 30-звенный олигонуклеотид MI*, несущий на 3'-конце остаток биотина (*) (рис. 3.11, вариант А). После гибридизации и удаления непрореагировавших молекул (с помощью промывок) обнаружение образовавшихся комплексов проводили с помощью конъюгатов - стрептавидин-щелочная фосфатаза или стрептавидин-обелин. Известно, что стрептавидин из стрептококка или его аналог авидин из белка куриных яиц обладают чрезвычайно высоким сродством к биотину (Кд = 10-15 М). Эти белки состоят из 4 одинаковых субъединиц, каждая из которых имеет сайт связывания с биотином.

Таким образом, стрептавидин (или авидин) часто используют в качестве стабильного и специфического мостика для формирования межмолекулярных комплексов, в том числе и при иммуноанализе. Образовавшиеся комплексы со щелочной фосфатазой обнаруживали спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность продукта ее реакции с субстратом. Комплексы с обелином обнаруживали, измеряя интенсивность светового потока, возникающего при добавлении ионов Са . На этом же рисунке показан другой вариант обнаружения гибридов (рис. 3.11, вариант Б) с помощью наращивания дуплекса ферментативным удлинением зонда с помощью Taq-полимеразы в присутствии биотинилированного производного дезоксиуридинтрифосфата (dUTP*).

Другой вариант проведения гибридизационного анализа показан на рис. 3.12. В данном случае при проведении ПЦР были использованы химически синтезированные праймеры, имеющие на концах биотиновые группы. Полученные при этом биотинилированные ампликоны иммобилизовали на поверхности, предварительно активированной стрептавидином.

Вариант проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Специфический зонд содержит поли-А-последовательность, метка представляет собой химический конъюгат репортерного белка обелина с олигонуклеотидом
Рис. 3.12. Вариант проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Специфический зонд содержит поли-А-последовательность, метка представляет собой химический конъюгат репортерного белка обелина с олигонуклеотидом

Для обнаружения ампликонов использовали зонд, состоящий из двух частей - химически синтезированного фрагмента, комплементарного определенному участку матрицы, и поли-А-фрагмента, присоединенного с помощью терминальной трансферазы. После гибридизации полученные дуплексы обнаруживали с помощью обелиновой метки, представляющей собой химически синтезированный конъюгат обелина с олигонуклеотидом dT30.

Современные методы позволяют проводить диагностику на исходном материале (клинические образцы крови, кала, мочи, смывах слизистых) без дополнительной очистки. Если концентрация ДНК-мишени слишком мала, ее амплифицируют с помощью ПЦР.



Первым сертифицированным методом такого рода был метод определения Chlamidia и gonococci в 1988 г. Сейчас целый ряд фирм производят диагностические наборы для обеспечения нужд медицинских аналитических лабораторий. Некоторые коммерческие диагностикумы, производимые в США, представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.2. Коммерческие инфекционные диагностикумы, производимые в США
Коммерческие инфекционные диагностикумы, производимые в США

Приведенные данные показывают, что современные диагностикумы являются высокочувствительными, скоростными и надежными.

В России также существует ряд фирм, производящих аналогичные диагностические наборы, одним из крупнейших является ООО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Однако необходимо отметить, что, к сожалению, удельный вес импортных диагностикумов на российском рынке значительно выше отечественных.

Помимо обнаружения инфекционных агентов, ДНК-диагностика применяется для выявления генов наследственных заболеваний. ДНК-анализ используют для выявления носителей генов заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики генетических нарушений. Ранее для определения специфических мутаций использовали биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты устанавливают мутации непосредственно в последовательности гена без экспрессии и изучения кодируемого белка.

В настоящее время разработан целый ряд различных методов скрининга гензаболеваний. Ранее был рассмотрен метод, основанный на выявлении измененных сайтов рестрикции (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Такие мутации приводят к образованию набора рестрикционных фрагментов ДНК, который отличается от набора фрагментов нормальной ДНК. Этот подход успешно используется для диагностики тяжелейшего наследственного заболевания - серповидноклеточной анемии.

Серповидноклеточная анемия - заболевание, обусловленное заменой одного нуклеотида в кодоне, соотвествующем шестой аминокислоте в в -цепи молекулы гемоглобина. В результате вместо валина на этом месте находится глутаминовая кислота, что приводит к искажению конформации гемоглобина и, как следствие, неэффективному переносу кислорода, осуществляемому этим белком. Индивиды, гомозиготные по мутантному гену (S/S), имеют эритроциты серповидной формы и страдают тяжелой анемией, приводящей к поражениям сердца, легких, мозга и других органов.

Индивиды, гетерозиготные по данному гену (A/S), являются носителями данного заболевания и страдают от него только в экстремальных условиях при снижении снабжения организма кислородом. Оба гетерозиготных родителя с вероятностью 25 % произведут на свет дитя, гомозиготное по этому признаку, т.е. больного серповидноклеточной анемией. Один из используемых тестов основан на рестрикционном анализе в-глобинового гена (рис. 3.13).

Выявление мутантного гена, ответственного за развитие серповидноклеточной анемии: Р1, Р2 - праймеры для амплификации; AA - гомозиготность по нормальному в-глобиновому гену; AS - гетерозиготность; SS - гомозиготность по гену анемии
Рис. 3.13. Выявление мутантного гена, ответственного за развитие серповидноклеточной анемии: Р1, Р2 - праймеры для амплификации; AA - гомозиготность по нормальному в-глобиновому гену; AS - гетерозиготность; SS - гомозиготность по гену анемии

В нормальном гене интересующий нас участок имеет последовательность CCTGAGG, в мутированном - CCTGTGG . В первом случае последовательность представляет собой сайт для рестрикцирующей эндонуклеазы Cvn1, а во втором - этот сайт отсутствует. Тестируемую ДНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих сайт Cvn1. Амплифицированный фрагмент обрабатывают Cvn1 и разделяют продукты рестрикции с помощью гель-электофореза.

При этом получают различный набор полос: нормальный ген содержит 3 сайта рестрикции и гомозиготный образец (А/А) демонстрирует 4 фрагмента на электрофореграмме. Мутантный ген содержит 2 сайта рестрикции, и гомозиготный образец (S/S) имеет 3 рестрикционных фрагмента, один из которых обладает большой молекулярной массой. Гетерозиготный образец имеет суммарный набор фрагментов того и другого гена. Таким образом, генетический статус обследуемого устанавливают довольно быстро без гибридизационного анализа продуктов амплификации.

Если однонуклеотидные замены не приводят к изменению сайтов рестрикции известных рестриктаз, их можно устанавливать с помощью других методов. Один из них сочетает ПЦР и метод лигирования («сшивки») олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ. Схема проведения такого анализа показана на рис. 3.14. Рассмотрим случай, когда в определенном положении произошла замена T— G.

Вначале синтезируют короткие олигонуклеотиды, комплементарные участкам, прилегающим к данному сайту справа и слева и помеченные разными гаптенами: зонд X помечен биотином, а Y - дигоксигенином (дигоксигенин - стероид, выделенный из наперстянки)). Обе ДНК амплифицируют и проводят отжиг с обоими зондами. Нормальная ДНК-мишень гибридизуется с обоими зондами полностью и при добавлении ДНК-лигазы ковалентно сшиваются. В мутантной ДНК зонд Х не образует пару с концевым нуклеотидом и ДНК-лигаза не может сшить эти два фрагмента.

На следующей стадии проводят денатурацию ДНК и переносят полученные смеси в пластиковую лунку, на поверхности которой иммобилизован стрептавидин. Биотинилированные молекулы ДНК связываются со стрептавидином, а весь несвязавшийся материал удаляют промывкой. Затем в лунку вносят антитела к дигоксигенину, помеченные каким-либо ферментом, например пероксидазой.

При внесении хромогенного субстрата в лунках с нормальной ДНК, где произошло лигирование, произойдет окрашивание субстрата. (Узнаете вариант ELISA?) Если окрашивания не наблюдается, значит, лигирования не произошло и мы имеем мутированную ДНК. Используя две пары зондов, комплементарных нормальному и мутированному сайту, можно определить генетических статус индивида - является ли он гомо- или гетерозиготным носителем данной мутации.

ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом, осуществляемым в автоматизированном режиме. Более простой вариант этого метода - это метод лигазной цепной реакции. Для реакции используют большие избытки обоих индикаторных зондов X и Y и термостабильную ДНК-лигазу. Лигирование проводят при 65 °С, затем денатурируют образовавшиеся гибриды при 95 °С и вновь понижают температуру до 65 °С для гибридизации свободных нелигированных зондов с ДНК-мишенью. Цикл повторяют 20 раз. Если комплементарность мишени и зондов полная, то за это время накопится достаточное количество продуктов лигирования для обнаружения электрофорезом или ELISA. При неполной комплементарности продуктов лигирования не будет.

Определение однонуклеотидной замены методом ПЦР-ЛОЗ: Б - биотин; Д - дигоксигенин S - субстрат; Р - окрашенный продукт
Рис. 3.14. Определение однонуклеотидной замены методом ПЦР-ЛОЗ: Б - биотин; Д - дигоксигенин S - субстрат; Р - окрашенный продукт

Молекулярная диагностика - это быстро развивающееся направление. Основные его принципы сформированы, но разработка новых технических деталей (миниатюризация образцов, высокоэффективный анализ с использованием технологий наночипов и пр.) могут существенно повысить его эффективность. Увеличение количества ДНК-мишени с помощью ПЦР позволила на несколько порядков повысить чувствительность анализа и открыла возможность детектирования, например, нескольких частиц вируса СПИДа, или проведения ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена у плода, используя в качестве материала небольшое число клеток околоплодной жидкости.

В заключение необходимо отметить, что возможности, которые предоставляет анализ с помощью ПЦР, предъявляют повышенные требования к условиям его проведения. Существует даже английская поговорка «Garbage in, garbage out», иными словами, нуклеиновый анализ хорош ровно настолько, насколько высоко качество реагентов, составляющих реакционную смесь.

Важнейшим условием успешного анализа является устранение возможности контаминаций. Далее приведены основные правила проведения ДНК-анализа:
- обеспечение «чистого» пространства для проведения анализа: помещения с пониженным давлением воздуха; фильтрующие пипетки, блокирующие аэрозоли наконечники к пипеткам, UV-оборудованный ПЦР-блок;
- использование оборудования для защиты персонала: одноразовые перчатки и лабораторные костюмы, которые не выносятся из аналитического блока, для предотвращения попадания примесных ДНК или нуклеаз из внешней среды;
- использование технологии «горячего старта» для минимизации событий ошибочных праймингов;
- использование контролей в каждом тесте: внешние позитивные и негативные контроли отслеживают правильность условий анализа и контаминации, внутренний контроль отслеживает наличие ингибиторов в реакционной смеси.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы