Масс-спектрометрия в биотехнологии

04 Января в 12:58 2391 0


Масс-спектрометрия - это физико-химический метод измерения отношения массы ионов к их заряду. Приборы, которые используются в этом методе, называются масс-спектрометрами или масс-спектрометрическими детекторами, они имеют дело с материальным веществом, состоящим, как известно, из мельчайших частиц - молекул и атомов.

Масс-спектрометры устанавливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный состав, а также пространственную структуру расположения атомов.

Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что существенно для установления ее механизмов.

Значительное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов заключается в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами (например, такие методы, как ИК-, УФ-, КР- и ЯМР), а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества, и в отличие от вышеуказанных методов, является деструктивным методом анализа, т.е. из образующихся при разрушении молекулы ионов исходная молекула регенерироваться не может. Метод масс-спектрометрии основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой фазе, которое происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда, и регистрации разделенных ионов.

Для представления масс-спектральных данных часто пользуются графиками, называемыми масс-спектрами.

Масс-спектр - это распределение заряженных частиц по их интенсивностям в соответствии с отношениями их масс к зарядам. Следовательно, первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, перевести нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией и осуществляется различными способами.

Масс-спектр диметисульфоксидного производного пальмитолеиновой кислоты из Ralstonia eutropha
Рис. 6.14. Масс-спектр диметисульфоксидного производного пальмитолеиновой кислоты из Ralstonia eutropha. Молекулярная масса компонента составляет 362, а идентифицирующими ионами положения двойной связи в молекуле являются 145 и 217 m/z

Следовательно масс-спектрометрия (масс-спектральный анализ) - метод анализа вещества путем определения массы (чаще отношения массы к заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества. В качестве иллюстрации приведен масс-спектр дисульфидного производного метилового эфира пальмитолеиновой кислоты, выделенной из бактерий Ralstonia eutropha (рис. 6.14).

Начало развитию масс-спектрометрии положено опытами Дж. Томсона (1910), исследовавшего пучки заряженных частиц, разделение которых по массам производилось с помощью электрического и магнитных полей, а спектр регистрировался на фотопластинки. Первый масс-спектрометр построен А. Демпстером в 1918 г., а первый масс-спектрограф создал Ф. Астон в 1919 г.; он же исследовал изотопный состав большого числа элементов. Первый серийный масс-спектрометр создан А. Ниром в 1940 г.; его работы положили начало изотопной масс-спектрометрии.

Прямое соединение масс-спектрометра с газо-жидкостным хроматографом (1959) дало возможность анализировать сложные смеси летучих соединений, а соединение с жидкостным хроматографом с помощью термораспылительного устройства (1983) смеси труднолетучих соединений.

Любой масс-спектрометр сочетает комплекс процессов, протекающих в нем. Так, сначала происходит ионизация молекул с образованием газообразных ионов, затем идет разделение ионов, регистрация их масс и относительных количеств.

Каждый ион, который может быть положительным или отрицательным, характеризуется отношением его массы к заряду (m/z). В соответствии с этим отношением происходит разделение различных ионов. В масс-спектрометре исследуемое вещество переводится в газообразное состояние до или в процессе ионизации.

Macс-спектральные приборы. Для разделения ионов исследуемого вещества по величинам m/z, измерения этих величин и токов разделенных ионов используют масс-спектральные приборы.

Принципиальная схема масс-спектрометра
Рис. 6.15. Принципиальная схема масс-спектрометра

Масс-спектральные приборы состоят из системы ввода пробы (система напуска), ионного источника, разделительного устройства (масс-анализатора), детектора (приемника ионов), вакуумных насосов, обеспечивающих достаточно глубокий вакуум во всей вакуумной системе прибора, и системы управления и обработки данных (рис. 6.15).

В современных приборах обработка данных и контроль задаваемых параметров производятся компьютером.

Превращения нейтрального атома или молекулы в заряженную частицу путем удаления из них или присоединения к ним одного или нескольких электронов называется ионизацией. Ионный источник предназначен для образования газообразных ионов исследуемого вещества и формирования ионного пучка, который направляется далее в масс-анализатор. Наиболее универсальный метод ионизации вещества - электронный удар. Впервые этот метод осуществлен П. Ленардом (1902). Современные источники такого типа построены по принципу источника А. Нира.

Для ионизации молекул обычно используют электроны с энергиями  70-100 эВ, которые движутся со скоростью 1000000000см/с и проходят путь, равный диаметру молекулы органического соединения за 10 -16с. Этого времени достаточно для удаления электрона из молекулы вещества и образования молекулярного иона - положительно заряженного ион-радикала М+, имеющего энергию 2-8 эВ.

Молекулярные ионы в зависимости от избытка внутренней энергии находятся в различных возбужденных состояниях, что обуславливает различное время их фрагментации или диссоциации. Обычно такой процесс протекает за время 10-13 с. При этом молекулярные ионы превращаются в осколочные (фрагментные) ионы с более низкой электронной энергией. Фрагментные ионы, которые обладают еще достаточным избытком колебательной энергии, претерпевают дальнейший распад. Этот процесс продолжается до тех пора, пока не будет израсходован весь избыток внутренней энергии, присущий родоначальному молекулярному иону.

Образование фрагментных ионов характеризуется энергией (потенциалом) появления, т.е. минимальной энергией электронов, при которой начинает детектироваться соответствующий ион. Нетрудно представить, что энергия появления молекулярного иона есть не что иное, как энергия ионизации молекулы.

При распаде молекулярного иона, который является нечетно-электронной частицей, образуются фрагментный ион и нейтральная частица, которая может быть как четно-электронной, так и нечетно-электронной, т.е. радикалом типа H", "CH3 и т.д.

При отщеплении нейтральной частицы возникает новый нечетно-электронный ион-радикал:
При отщеплении нейтральной частицы возникает новый нечетно-электронный ион-радикал


а при выбросе радикала - четно-электронный ион:
а при выбросе радикала - четно-электронный ион
Дальнейшие направления распада этих ионов различны. Нечетно-электронный ион [Ф1]+" способен далее подобно М+" элиминировать либо нейтральную четно-электронную молекулу, либо радикал, в то время как катион [Ф2]+ в подавляющем большинстве случаев может терять лишь четно-электронную молекулу (четно-электронное правило).

Таким образом, процессы фрагментации молекулярных ионов характеризуются значительным числом последовательных и конкурирующих направлений распада, вероятность которых определяется природой молекулы и элементов, ее составляющих, энергией разрывающихся связей, внутренней энергией образующихся ионов, стабильностью ионов и элиминирующихся нейтральных частиц, а также временным интервалом между образованием иона и его детектированием.

Ионы с минимальным запасом энергии достаточно устойчивы и достигают приемника. Ионы с большим запасом внутренней энергии распадаются на пути движения на ионы с меньшей молекулярной массой (осколочные ионы), характерные для вещества определенного строения. Для ионизации молекул энергия электронного пучка должна превышать некоторую критическую для вещества величину, называемую потенциалом ионизации.

Потенциалы ионизации лежат в пределах 3,98 эВ (Fr- 24,58 эВ (Не), для большинства органических соединений - 7-11 эВ. Используя моноэнергетические пучки электронов и снижая их энергию до пороговых значений, можно определять потенциалы ионизации вещества и потенциалы появления ионов - критическую энергию электронов, при которой в спектре появляются линии соответствующих осколочных ионов.

При ионизации электронным ударом происходит перераспределение энергии возбуждения по колебательным степеням свободы иона, прежде чем этот ион распадается. Предположение о квазиравновесном распределении энергии возбуждения позволяет полуэмпирическим путем рассчитать масс-спектры некоторых веществ, согласующиеся с экспериментальными данными. Однако во многих случаях, особенно для длинных молекул, эта теория не подтверждается.

Для двухатомных молекул изменения колебательного состояний объясняют, исходя из принципа Франка - Кондона. При взаимодействии низкоэнергетических электронов (менее 10 эВ) с веществом могут осуществляться процессы резонансного захвата электронов молекулами с образованием отрицательно заряженных ионов. Масс-спектр электронного удара - высокочувствительный метод анализа, он позволяет анализировать пикомольные количества вещества, его предпочитают использовать для исследования структуры соединений.

Существуют «библиотеки» масс-спектров, содержащие спектры более 350 000 органических соединений, по которым можно проводить их идентификацию с применением ЭВМ. Недостатки метода: молекулярные ионы образуются лишь у 20 % органических соединений; метод применим только для определения легколетучих термически стабильных соединений; в значениях полного ионного тока на ионы с большими значениями m/z, дающими информацию о молекулярной массе и наличии функциональных групп, приходится меньшая часть; отрицательно заряженные ионы, имеющие большое значение в структурном анализе, образуются в очень небольшом количестве и в ограниченном числе органических соединений.

Для решения части проблем применяют метод химической ионизации, которая осуществляется при столкновении молекул исследуемого вещества с ионами реагентного газа, в качестве которого используются индивидуальные вещества или их смеси. Реагентный газ находится в источнике под давлением 65-130 Па, парциальное давление исследуемого вещества - 0,1-0,01 Па. При бомбардировке такой смеси электронами с энергией 70-500 эВ преимущественно ионизируются молекулы реагентного газа. Образовавшиеся положительно заряженные ионы в результате ионно-молекулярных столкновений с неионизированными молекулами реагентного газа преобразуются в реактантные ионы, которые, в свою очередь, взаимодействуют с молекулами исследуемого вещества и ионизируют их, образуя ионы МН+.

Наиболее используемые реагентные газы и их характеристики приведены в табл. 6.3. Химическая ионизация с образованием положительно заряженных ионов может осуществляться также в результате переноса заряда с реактантных ионов, например, Не+' , Ar+' , N2+', СО+', NO+' на молекулы исследуемого вещества; при этом образуется молекулярный ион М+. Масс-спектры химической ионизации с реагентными газами Ar и N2 напоминают спектры электронного удара. Метод химической ионизации позволяет оценивать кислотно-основные свойства органических соединений в газовой фазе. Химическая ионизация с образованием отрицательно заряженных ионов осуществляется в результате взаимодействия исследуемых молекул с ионами NH2-, OH-, СН30-(сродство к протону, соответственно, 1682, 816 и 778 кДж/моль).

Таблица 6.3. Реагентные газы и их характеристики
Реагентные газы и их характеристики

Последние образуются при захвате молекулами NH3, H2O и СН3ОН электронов с пониженной энергией (около 6 эВ) с последующим распадом образовавшихся молекулярных ионов М- (диссоциативный захват). Ионы OH-, CH3O- образуются в значительном количестве при электронной бомбардировке смесей N2O с СН4 или (СН3)3СН, Н2О и N2O с СН3ОН. Часто метод химической ионизации более чувствительный, чем метод ионизации электронным ударом, т. к. практически все имеющиеся в ионизационной камере электроны используются для ионизации. Метод позволяет анализировать пространственные и оптические изомеры. Его важное достоинство - большой выход протонированных молекулярных ионов МН+ при малом выходе осколочных ионов.

Другим методом мягкой ионизации является полевая десорбция. Полевая десорбция - это образование ионов в сильном электростатическом поле (108 В/см) за счет квантово-механического туннельного эффекта. Полевая десорбция может происходить при низких температурах эмиттера и не сопровождаться диссоциацией. В результате образуются в основном молекулярные и квазимолекулярные ионы.

Так, например, в масс-спектре электронного удара ацетилсалициловой кислоты преобладают продукты диссоциативной ионизации с m/z, равным 140 и 120, а в масс-спектре полевой десорбции есть только два пика: молекулярный с М = 180 и квазимолекулярный с М = 181, образованный путем присоединения протона к молекуле ацетилсалициловой кислоты. Однако несмотря на определенные успехи, этот метод не получил достаточно широкого применения в связи с его избирательностью.

Далеко не все молекулы отдают поверхности электрон при низких температурах. Для ионизации труднолетучих соединений в масс-спектрометрии применяются искровая и лазерная ионизация вещества. Ионизации подвергается твердое вещество. В искровом источнике испарение и ионизация исследуемого вещества происходят за счет искрового разряда, зажигающегося между электродами при разности потенциалов между ними от 3 до 5 кВ. На одном из электродов находится сам образец.

Лазерная ионизация производится путем импульсного лазерного нагрева твердого вещества, и образующийся плазменный пучок направляется в масс-анализатор. В этих условиях происходит полное разрушение химических соединений, и в масс-спектре фиксируются лишь атомные ионы и определяется элементный состав образца. Похожие результаты можно получить, производя испарение и ионизацию твердого вещества ионами или нейтральными атомами с энергией в несколько киловольт. Эти методы широко применяются для элементного анализа.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы