Масс-спектрометрия в биотехнологии. Масс-анализаторы

04 Января в 13:27 2196 0


Масс-анализаторы - устройства для пространственного или временного разделения ионов с различными значениями m/z в магнитном или электрических полях или их комбинациях.

Различают статические и динамические анализаторы. В статических ионы разделяются в постоянных или практически не изменяющихся за время их движения через анализатор магнитных полях. Ионы с различным значениями m/z движутся в таком анализаторе по разным траекториям и фокусируются последовательно на щель детектора в результате плавного изменения напряженности электрического и магнитного полей анализатора.

В динамических анализаторах разделение ионов происходит под воздействием импульсных или радиочастотных электрических полей с периодом изменения, меньшим или равным времени пролета ионов через масс-анализатор. Ионы с различным значениями m/z, как правило, разделяются по времени пролета определенного расстояния. Давление в анализаторах должно быть достаточно низким (~10-5Па), чтобы избежать рассеяния ионов на молекулах остаточных газов.

Основные характеристика масс-анализатора - его разрешающая способность, или разрешающая сила R. Она характеризует способность анализатора разделять ионы с незначительно отличающимися друг от друга массами и определяется отношением значения массы иона М к ширине его пика АМ (выраженной в атомных единицах массы) на определенном уровне высоты пика (обычно 50 или 10 %): R = М/АМ. Например, R = 10 000 означает, что масс-анализатор может разделять ионы с массами 100,00 и 100,01.

Наиболее часто применяют статистические масс-анализаторы с однородным магнитным полем (одинарная фокусировка) или комбинацией электрических и магнитных полей (двойная фокусировка). В масс-анализаторах с одинарной фокусировкой ионный луч, сформированный в источнике ионов, выходит из щели шириной S1 в виде расходящегося ионного пучка и в магнитном поле разделяется на пучки ионов с различным значениями m/z.

Под действием поля, силовые линии которых направлены перпендикулярно направлению движения ионного пучка, ионы двигаются по круговой траектории с радиусом
Под действием поля, силовые линии которых направлены перпендикулярно направлению движения ионного пучка, ионы двигаются по круговой траектории с радиусом
где V - напряжение, ускоряющее ионы; mn - масса иона; z - заряд иона; H -напряженность магнитного поля.

Ионы с одинаковой кинетической энергией, но с разными массами или зарядами проходят через анализатор по различным траекториям. Обычно развертка масс-спектра (регистрация ионов с определенными значениями m/z) осуществляется изменением Н при постоянном V. Разброс ионов, вылетающих из ионного источника, по кинетическим энергиям, а также несовершенство фокусировки по направлениям приводят к уширению ионного пучка, что сказывается на разрешающей способности.

Для статического масс-анализатора
Для статического масс-анализатора
где S1 и S2 - соответственно, ширина входной и выходной щелей; б - уширение пучка в плоскости выходной щели.

Уменьшение размера щелей для увеличения разрешающей способности прибора трудно осуществимо технически и, кроме того, приводит к очень малым ионным токам, поэтому обычно конструируют приборы с большим радиусом траектории ионов (r = 200-300 мм). Разрешающая способность может быть повышена также при использовании масс-анализаторов с двойной фокусировкой. В таких приборах ионный пучок пропускают сначала через отклоняющее электрическое поле специальной формы, в котором осуществляется фокусирование пучка по энергиям, а затем через магнитное поле, в котором ионы фокусируются по направлениям.

Существует более 10 типов динамических масс-анализаторов: квадрупольный, время-пролетный, циклотронно-резонансный, магнитно-резонансный, радиочастотный, фарвитрон, омегатрон и др. Наиболее широко применяемый масс-анализатор - квадрупольный. Этот масс-анализатор представляет собой квадрупольный конденсатор (рис. 6.16), к парам параллельных стержней которого приложены постоянное напряжение V и переменное высокочастотное V0cos wt (w- частота; t - время); их суммы для каждой пары равны по величине и противоположны по знаку.

Схема квадрупольного масс-анализатора
Рис. 6.16. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1 - высокочастотный генератор; 2 - генератор постоянного напряжения; 3 - генератор развертки; 4 и 5 - источник и детектор ионов

Ионы, вылетевшие из ионного источника, движутся в камере анализатора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным объемным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания вдоль осей x и у. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения ионы с определенными значениями m/z проходят через квадрупольный конденсатор, у ионов с другими значениями m/z амплитуда поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о стержни и разряжаются на них.

Развертка масс-спектра производится путем изменения постоянного и переменного напряжения или частоты. Для современных квадрупольных масс-спектрометров R = 8000. Первый квадрупольный прибор построен В. Паули и X. Штайнведелем (ФРГ, 1953).

Время-пролетный масс-анализатор представляет собой эквипотенциальное пространство, в котором дрейфуют ионы, разделяясь по скоростям движения. Ионы, образующиеся в ионном источнике, очень коротким электрическим импульсом «впрыскиваются» в виде «ионного пакета» через сетку в анализатор. В процессе движения исходный ионный пакет расслаивается на пакеты, состоящие из ионов с одинаковыми значениями m/z. Скорость дрейфа отслоившихся ионных пакетов и, следовательно, время их пролета через анализатор длиной L вычисляется по формуле
Скорость дрейфа отслоившихся ионных пакетов и, следовательно, время их пролета через анализатор длиной L вычисляется по формуле (6.32)
где V - напряжение.

Совокупность таких пакетов, поступающих в детектор, образует масс-спектр. Для современных приборов R = 5 000-10 000. Первый прибор создан А. Камероном и Д. Эгтерсом (США, 1948), а в СССР - Н.И. Ионовым (1956).

Детекторы (приемники) ионов помещают на выходе прибора. Для детектирования используют электрометрические усилители, позволяющие измерять ионные токи до 10-14А, электронные умножители и сцинтилляционные детекторы с фотоумножителем, которые обеспечивают счет отдельных ионов (ток 10-19А) и имеют малую постоянную времени. Обработка данных на современных приборах идет на компьютере.

Применение масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия широко применяют в различных областях науки и техники. Большие успехи достигнуты при анализе биологически важных продуктов биотехнологии; показана возможность структурного анализа полисахаридов с молекулярной массой до 15000, белков - до 45 000 и т.д.

Большие принципиальные возможности масс-спектрометрии появляются при сочетании её с другими методами. Сочетание методов значительно расширяет возможности каждого из них, позволяя получать больше информации об объекте исследования. Созданы тандемные масс-спектрометры, позволяющие двукратное, трехкратное, четырехкратное и т.д. разделение по массам.

Хромато-масс-спектрометры - одни из наиболее распространенных современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предварительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измерение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому масс-спектрометры в хромато-масс-спектрометрах большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями.



Весьма плодотворным, но далеко не в полной мере реализованным, оказалось совместное применение лазеров и масс-спектрометрии, которое может идти по двум - трем направлениям: применение лазеров в масс-спектрометрии, применение масс-спектрометрии для диагностики и изучения работы лазеров, масс-спектрометрический контроль работы установок по лазерному разделению изотопов.

Более распространенным и относительно простым является применение масс-спектрометрии в аналитических целях. Условия ионизации в этих случаях, как правило, либо остаются неизменными, либо контролируемым образом переключаются между несколькими значениями. Масс-спектрометрия как область аналитических измерений требует довольно сложных приборов, основательного методического и метрологического обеспечения.

Она объединяет и согласует длинную цепочку объектов, методов и процессов: объект исследования; подготовку эталонов, поверочных смесей или образцов сравнения; метод отбора и подготовки проб; ионизацию вводимого вещества; разделение ионов по массам; их детектирование; обработку и представление полученной информации; её анализ и последующие выводы.

Работы по осуществлению этой цепочки требуют использования разнообразных систем и узлов масс-спектрометров. Эти методы обладают хорошей наглядностью, большой универсальностью и информативностью, позволяют достигать высокой чувствительности, разрешающей способности и точности, что способствует их широкому распространению в различных отраслях науки и технологии.

Масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией активно используется в СФУ для решения ряда биотехнологических задач.

Масс-спектры основных диеновых углеводородов изолята Botryococcus озера Шира
Рис. 6.17. Масс-спектры основных диеновых углеводородов изолята Botryococcus озера Шира: а - 29:2; б - 29:3

Так, например, с помощью масс-спектрометрии были идентифицированы углеводороды двух представителей Botryococcus - музейного штамма и изолята озера Шира. На рис. 6.17 представлены масс-спектры основных углеводородов, выделенных из природного штамма Botryococcus braunii. На данных спектрах четко видны основные молекулярные ионы, характерные для доминирующих диенового и триеного углеводородов С29:2 и С29:3, а фрагментация молекул соответствует углеводородным цепям с двумя и тремя ненасыщенными связями.

Идентификацию ацетиленовых кислот, синтезируемых водным мхом, проводили также по масс-спектрам. Но положение двойных и тройных связей в ненасыщенных кислотах определяли после получения диметилоксазолиновых производных фракции жирных кислот (ДМОК) и последующего хроматографирования их в тех же условиях, что и метиловые эфиры жирных кислот. На рис. 6.18 приведены масс-спектры метиловых эфиров двух ацетиленовых кислот и их ДМОК.

Масс-спектры метиловых эфиров основных ацетиленовых кислот липидов Fontinalis antipyretica
Рис. 6.18. Масс-спектры метиловых эфиров основных ацетиленовых кислот липидов Fontinalis antipyretica: а - 6a, 9, 12-18:3 (А1); б - 8a, 11, 14-20:3 (А5) и их диметилоксазолиновых производных: в - 6a, 9, 12-18:3 (А1); г - 8a, 11, 14-20:3 (А5). Точками отмечены диагностические фрагменты, молекулярный вес которых отличается на 10 или 12 ам

Совершенная масс-спектрометрическая техника позволяет изучать полимерные молекулы, синтезируемые бактериями - полигидроксиалканоаты. На рис. 6.19 приведены две ионные хроматограммы 4- и 5-компонентных полимеров и масс-спектры соответствующих мономеров, из которых состоят полимеры.

Ионные хроматограммы полимеров, выделенных из биомассы Ralstonia eutropha В5786 с добавкой гептаноата (верх) и добавкой октаноата (зеркально внизу) и масс-спектры соответствующих мономеров - ГБ -в-гидроксибутират с временем удерживания 7,37; ГВ -в-гидроксивалерат - 8,42; ГГ - в-гидроксигексаноат - 9,48; ГГеп -в-гидроксигептаноат - 10,75; ГО -в-гидроксиоктаноат - 11,95
Рис. 6.19. Ионные хроматограммы полимеров, выделенных из биомассы Ralstonia eutropha В5786 с добавкой гептаноата (верх) и добавкой октаноата (зеркально внизу) и масс-спектры соответствующих мономеров - ГБ -в-гидроксибутират с временем удерживания 7,37; ГВ -в-гидроксивалерат - 8,42; ГГ - в-гидроксигексаноат - 9,48; ГГеп -в-гидроксигептаноат - 10,75; ГО -в-гидроксиоктаноат - 11,95

Масс-спектры в-гидрокси-кислот характеризуются наличием базового иона 103 m/z . Следовательно, все отмеченные на хроматограмме пики относятся к в-гидроксикислотам, а их длина определена по их временам удерживания.

Фундаментальные физические законы, передовые научные и инженерные разработки, высокотехнологичные вакуумные системы, самые лучшие материалы, высочайшее качество их обработки, современнейшая быстродействующая цифровая и аналоговая электроника и компьютерная техника, а также программное обеспечение - основы современных масс-спектрометров.

Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ. С ее помощью стала возможным разработка новых лекарственных средств, контроль их производства. Она дала существенное продвижение в области генной инженерии, биохимии и протеомике.

Целый ряд техногенных (т.е. не существующих в природе, а появившихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являются супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Примером является хорошо известный диоксин. Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии.

С ее помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота. Конечно, и медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человека Helicobacter pylori и является самым надежным из всех методов диагностики.

Таким образом, масс-спектрометрия в настоящее время является одним из наиболее информативных, чувствительных и надежных аналитических методов. Любая крупная физическая, химическая или биологическая лаборатория имеет в своем распоряжении масс-спектрометр, ориентированный на те или иные специфические исследования.

Совершенствование техники позволило создать приборы, способные исследовать молекулы с огромными массами порядка 100 000 а.е.м. и выше, что, несомненно, открывает просторы для изучения таких сложных биологических молекул, как белки и нуклеиновые кислоты. Масс-спектрометрия способна обнаруживать примеси на уровне 0,0001 % и ниже, что актуально при контроле синтеза высокочистых веществ, например в микроэлектронике и медицинской биотехнологии.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы