Культура протопластов: изоляция протопластов

29 Декабря в 19:03 2670 0


Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его поверхность защищена только плазмолеммой.

Изоляция протопластов

Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:
- невысокая производительность;
- возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;
- трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

По сравнению с механическим энзиматический метод обладает следующими преимуществами:
- одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн из грамма ткани или клеток);
- клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;
- клетки не повреждаются;
- метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы.

Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:
1) обработка ферментами;
2) выделение протопластов из клеточных стенок;
3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация. Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт «голый», один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.

Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3-0,8 моль/л. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.



Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды - 5,4-5,8, температура - 22-28 оС, невысокая освещенность (не более 2 000 лк).

Общее представление об этапах получения, культивирования in vitro протопластов и регенерации из них растений дано на рис. 4.15.

Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений
Рис. 4.15. Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений

Тотипотентность протопластов

Сразу после того, как отмыты ферменты, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микрофибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Через 2-4 дня протопласт может утратить сферическую форму, и произойдет полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от происхождения протопластов и культуральных условий может отмечаться отсутствие синтеза клеточной оболочки в течение нескольких недель или месяцев.

Одним из факторов культуральной среды, обусловливающим синтез клеточной стенки, является сахароза. В ее отсутствие синтеза клеточной стенки не происходит.

Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных колоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не сопровождается цитокинезом.

Формирование клеточной стенки не всегда является условием, достаточным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 % восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут происходить через 2-10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии могут стать источником растенийрегенерантов.

Первое сообщение о регенерации растений в культуре протопластов мезофилла табака было опубликовано в 1971 г. японскими исследователями. Наиболее хорошо отработаны методы изоляции и культивирования протопластов у представителей семейства Solanaceae и отдельных видов Brassica. Трудными объектами для получения протопластов, способных к реализации тотипотентности, являются однодольные растения, в том числе злаки, и хвойные.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы