Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

29 Декабря в 18:56 1819 0


Получение культуры отдельных изолированных клеток очень ценно для генетических и физиологических исследований, практического использования в клеточной селекции. Так, получение клона потомства одиночной клетки помогает установить причины генетической неоднородности каллусных клеток.

Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, тканей растений, из каллусных тканей или культуры протопластов после восстановления клеточной стенки. Для получения одиночных клеток иногда достаточно отстаивания суспензионной культуры (10-15 мин в колбе) или использования мацерирующих ферментов, центрифугирования в градиенте сахарозы либо фильтрования через сито.

Первые работы по изоляции клеток растений и получению изолированных клонов было выполнено в 1954 г. в Висконсинском университете, США. Отдельные клетки выделяли из рыхлой каллусной ткани табака, культивированной в жидкой питательной среде при постоянном встряхивании на шейке-ре. Трудности связаны с тем, что отдельные клетки не делятся в тех условиях, при которых растет каллусная ткань. Предварительные эксперименты показали, что при помещении отдельной изолированной клетки в культуральную среду ее деления не происходило.

Однако клоны из таких клеток удалось получить Мьюиру с соавторами с использованием метода ткани-«няньки». В этом случае изолированную клетку переносили на фильтровальную бумагу, смоченную питательной средой и помещенную на поверхность хорошо растущей каллусной ткани. Каллусная ткань индуцировала и поддерживала деление клетки, а затем и развитие клеточного клона. В тех же целях используют суспензионные культуры клеток (рис. 4.14).

Использование в качестве «няньки» культуры суспензионных клеток при выращивании одиночных клеток
Рис. 4.14. Использование в качестве «няньки» культуры суспензионных клеток при выращивании одиночных клеток: 1 - колонии клеток; 2 - фильтровальная бумага; 3 - алюминиевая сетка; 4 - пенополиуретан; 5 - суспензия клеток

Для индукции клеточных делений одиночных клеток можно использовать кормящий слой (активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений), отделенный от культивируемых одиночных клеток полупроницаемой мембраной.

Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего в нее добавляют питательную среду интенсивно делящейся культуры клеток. Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр.



Позже был разработан метод массового культивирования отдельных изолированных клеток - метод плейтинга (от the plate - чашка).

Метод состоит из следующих процедур:
- получение клеточной суспензии в жидкой питательной среде из хорошо растущей каллусной ткани;
- фильтрование суспензии через сито для удаления крупных клеточных агрегатов;
- приготовление 0,6-1 %-й агаровой среды того же состава, который был использован для поддержания роста суспензии;
- нагревание агаровой среды до жидкого состояния и перемешивание ее с равным количеством суспензии, которую необходимо разлить в чашки Петри слоем около 1 мм;
- определение местоположения отдельных клеток с использованием инвертированного микроскопа и нанесение пометок об их наличии на крышках чашек;
- культивирование в темноте при t = 25 °С;
- наблюдения за развитием одноклеточных клонов.

В экспериментах Бергмана около 20 % изолированных каллусных клеток табака делилось и образовывало колонии.

При данном способе культивирования, даже при недостаточно сбалансированном составе питательной среды, может происходить деление отдельных клеток. Это обусловлено тем, что в соседних колониях, образованных из мелких клеточных агрегатов, синтезируются ростовые вещества, которые выделяются в среду и стимулируют клеточное деление.

Метод микрокамеры разработан Джонсом в 1960 г., который может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной изолированной клетки.

Метод включает следующие процедуры:
- на предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом расстоянии наклеивают два покровных стекла;
- между покровными стеклами наносят квадрат из парафинового масла;
- в камеру из парафинового масла помещают каплю питательной среды с изолированной клеткой;
- сверху камеру накрывают третьим покровным стеклом;
- за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом.

Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения. К указанному методу близок способ Ю.Ю. Глеба - в микрокаплях.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы