Культура гаплоидных тканей

29 Декабря в 19:20 3036 0


Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом.

Уровень спонтанного возникновения гаплоидов очень низкий - примерно один гаплоид на 10 5-10 6 растений. Для повышения частоты образования гаплоидов используют разные приемы:
- воздействуют на процессы опыления и оплодотворения радиационным излучением или химическими веществами;
- опыляют растения чужеродной пыльцой, индуцирующей к развитию неоплодотворенную яйцеклетку;
- выполняют отдаленные скрещивания с такими генотипами, когда обеспечивается двойное оплодотворение, но в процессе развития зародышей происходит элиминация хромосом опылителя, что приводит к развитию гаплоидного зародыша материнского генотипа (метод гаплопродюссера);
- культивируют изолированные пыльники;
- культивируют неоплодотворенные завязи и семяпочки.

Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. По внешнему виду гаплоиды сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.

Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений.

Отдаленная гибридизация - важный метод формообразования и улучшения существующих сортов. Основная ее проблема - низкая совместимость или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоления эффективны различные модификации методов культуры тканей: своевременное изолирование и доращивание гибридных зародышей на питательных средах; каллусогенез при культивировании незрелых гибридных зародышей и регенерация растений из каллусных тканей.

Культура пыльников

Известны несколько методов создания гаплоидов в культуре изолированных тканей растений, имеющих свои преимущества и недостатки:
1 ) использование (введение в культуру) гаплоидных тканей нативного растения (пыльники, пыльцевые зерна, семяпочки);
2) гаплопродукции - создание условий для получения гаплоидной ткани на интактном растении (отдаленная гибридизация, приводящая к элиминации (абортированию) одного из родительских генотипов), а затем доращивание недоразвитого семени или зародыша.

Гут и Магешвари, впервые занявшиеся культурой пыльников, вызвали рост гаплоидных клеток действием кинетина, а рост диплоидных клеток -включением в среду ауксина, индолилуксусной кислоты (ИУК) с кинетином.

Затем последовали сообщения разных авторов о получении ими гаплоидов риса, рапса, ячменя, паслена черного, томата, эгилопсов, спаржи и других культур. В 70-х гг. из пыльцевых зерен уже получили гаплоиды 23 видов 5 семейств и 4 межвидовых гибрида.

В процессе культивирования пыльников в условиях in vitro имеет место андрогенез - развитие эмбриоидов, а затем и растений из мужских половых клеток (микроспор).

Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия «средних» или «поздних» одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.

Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества, неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов, ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей, в питательные среды добавляют активированный уголь.

Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4-6 С в течение 2-8 сут. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре (25+2) С.

На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидный зародыш (сначала формируется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов)  (рис. 4.16), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифферен-цируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды - морфогенный каллус и регенеранты.

Схема формирования андрогенных эмбриоидов
Рис. 4.16. Схема формирования андрогенных эмбриоидов

Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по ряду морфологических признаков. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов, и растений-регенерантов.

Как показали опыты, таким способом образуются не только гаплоидные, но и диплоидные и полиплоидные растения. Первые формируются из микроспор или из каллуса микроспоры, а диплоиды - из спонтанно удвоенных ядер, из клеток гаплоидного каллуса.



Пыльники капусты благоприятно реагируют на смесь кинетина и 2,4-Д, пыльники риса - на 2,4-Д или 1-нафтилуксусную кислоту (НУК). Исключительно активный рост пыльцы индуцирован у дурмана и рода Brassica кокосовым молоком, а у дурмана - и соком сливы. Эти продукты оказались для названных растений эффективнее, чем какие-либо синтетические индукторы.

У многих видов наилучший выход микроспор обеспечивается при предобработке культивируемых пыльников низкими температурами. У ячменя, например, обработка в течение 7-14 дней при 7 С дает оптимальные результаты.

Использование гаплопродюссеров и отдаленной гибридизации при получении гаплоидных тканей

Отдаленная гибридизация - важный метод формообразования и улучшения существующих сортов. Основная его проблема - низкая совместимость или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоления эффективны различные модификации методов культуры тканей: своевременное изолирование и доращивание гибридных зародышей на питательных средах; каллусогенез при культивировании незрелых гибридных зародышей и регенерация растений из каллусных тканей.

Недостатки отдаленной гибридизации можно превратить в достоинства и использовать их в позитивных целях, например, для получения гаплоидных тканей. Дело в том, что при отдаленной гибридизации очень часто образуется неполноценный (гаплоидный) потомок, поскольку генотип одной из родительских форм часто не сливается с другим родительским геномом и абортируется.

В результате этого образуется гаплоидная клетка, а развивающийся из нее зародыш оказывается щуплым, невыполненным, мало способным к формированию полноценного растения, что можно исправить с помощью культуры тканей.

Для ячменя успешно используется метод гаплопродукции на основе межвидовой гибридизации культурного ячменя (Н. vulgare) с луковичным - Н. bulbosum.

Показаны преимущества этого метода в сравнении с культурой пыльников. Существенное влияние на эффективность гаплопродукции оказывает ряд факторов: генотип исходных форм, степень дифференцировки незрелых гибридных зародышей, обработка гибридных колосьев растворами физиологически активных веществ, сроки посева и опыления исходных форм, состав питательных сред для доращивания зародышей способы колхицинирования и др.

Для получения гаплоидов пшеницы материнскими формами служат сорта и линии яровой и озимой пшеницы, в качестве опылителей используют Т. timopheevi, T. militinae, Т. tuigidum, Т. dicoccum, овес Ae. ovata, Ae. triaristata, рожь Памирская и др. - источники комплексной устойчивости к болезням и абиотическим стрессам, высокобелковости. В зависимости от комбинации завязываемость зерен варьирует от 0 до 66,4 %. In vitro прорастает от 5 до 100 % зародышей, регенерация зеленых растений составляет от 5 до 93,8 %. Использование таких подходов - действенный инструмент обогащения генофонда культурных растений и создания новых сортов.

Дигаплоиды столового картофеля получают путем опыления сортов пыльцой примитивных культурных диплоидных видов, способных индуцировать гаплопартеногенез. Из пыльцы полученных дигаплоидов в культуре микроспор отбирают формы со спонтанно удвоенными наборами хромосом и выраженными благоприятными генами, которые затем попарно скрещивают между собой. Слитые протопласты гибридов, сочетающие благоприятные гены, дают тетраплоиды с заданным генотипом.

Установлены некоторые причины нежизнеспособности гибридных семян. Удачным развитием этих работ стало использование метода эмбриокультуры для повышения эффективности отдаленной гибридизации.

Для получения в культуре гаплоидных тканей фертильных растений регенерантов вводится дополнительный этап - удвоение хромосом.

Для удвоения числа хромосом гаплоидов (диплоидизации) используют колхицин, антибиотики, декапитацию (срезание) верхушек; нередко самоудвоение наблюдают в культуре каллуса при эндомитозе. Образующиеся диплоидные клетки «забивают» гаплоидные и анеуплоидные ввиду более энергичного деления и роста. Растения, регенерировавшие из таких клеток и тканей, называют дигаплоидами.

Возможности гаплоидных технологий

Гаплоидные растения представляют интерес для генетики и селекции, так как каждый ген у гаплоида представлен единственным аллелем и рецессивные аллели у таких растений проявляются наряду с доминантными. Фенотип гаплоида полностью отражает их генотип, поэтому среди таких растений удобно отбирать формы с ценными мутациями.

Гаплоидная технология, отдаленная гибридизация с последующей эмбриокультурой, клеточная селекция, клональное микроразмножение, основанные на культивировании клеток, тканей и органов, уже вносят реальный вклад в селекцию растений.

Гаплоидные технологии значительно расширяют возможности селекции. Главное преимущество выращивания растений из пыльцы - быстрое создание чистых линий, что особенно важно для двудомных видов и облигатных перекрестников. Для планируемых скрещиваний селекционеры могут поддерживать родительские формы в культуре ткани вегетативно. В селекции на гетерозис создание линий не требует нескольких лет инбридинга.

Выращивание гаплоидов in vitro позволяет получать гомозиготные константные линии из гетерозисных гибридных популяций в короткие сроки и тем самым ускорять отбор положительных вариантов. Возможна оценка перспективных популяций на ранних этапах селекционного процесса.

К тому же гаплоидные клетки удобны для решения многих задач теоретического плана и для генно-инженерных манипуляций. От изучения гаплоидных клеточных линий генетики надеются получить более точные данные о природе генных мутаций и цитоплазматической наследственности.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы