Клональное микроразмножение растений

28 Декабря в 19:04 11019 0


В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:
1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет;

3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции);

4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью;

5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в 1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон от греч. clon - черенок (побег), пригодный для размножения.

Клон - популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.
Клональное микроразмножение - получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.

Этапы и методы клонального микроразмножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1 - выбор растения-донора (донор - растение, часть которого вводится в культуру), изолирование эксплантов (эксплант - ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2 - собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 - укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2-10  С); 4 - выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1).

Схема клонального микроразмножения растений
Рис. 4.1. Схема клонального микроразмножения растений: I путь -активация развития существующих меристем; II путь - индукция возникновения адвентивных почек; 1 - выбор исходного экспланта; 2 - получение стерильной культуры; 3 - образование адвентивных почек на первичном экспланте; 4 - рост почек и формирование микропобегов; 5 - размножение микропобегов; 6 - укоренение микропобегов; 7 - депонирование растений-регенерантов; 8 - акклиматизация растений к грунту; 9 - высадка регенерантов в поле

Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения.

В литературе предложены следующие методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Первый метод, используемый при клональном микроразмножении растений, - это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:

1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование - подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки.

2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) - часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков (рис. 4.2).

Активация развития уже существующих в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования
Рис. 4.2. Активация развития уже существующих в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования: 1 -снятие апикального доминирования и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормоналыюй среде; 2 - индуцированное развитие многочисленных пазушных побегов под действием веществ цитокининового типа действия

В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.).

Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу (рис. 4.3). Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.
Формирование растения капусты из пазушной почки показано на рис 4.4.

Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием
Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием: а - микропобег - объект черенкования (линиями отмечены места разрезов при черенковании); б - микрочеренок на питательной среде; в - развитие растения картофеля из черенка (фото Н.В. Зобовой)

Формирование растения капусты из пазушной почки на агаризованной питательной среде
Рис. 4.4. Формирование растения капусты из пазушной почки на агаризованной питательной среде (фото Н.В. Зобовой): а - введение в культуру пазушной почки; б - развитие побега; в - формирование регенеранта

Второй метод - это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно на тканях экспланта. (Адвентивный - добавочный побег. Развитие растений из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот.

Этот термин также может быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры). Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.


Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют в -индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или а-нафтилуксусную кислоту (НУК).

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) - из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; лук, чеснок - из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты - из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный - из сегментов листовых пластинок; петуния - из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрептокарпус, эшинапсус - из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений - из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

Несомненный интерес вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака установила, что именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды.

Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии, сенполии и стрептокарпуса процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок.

Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, Арнольд и Эрихсон, Джонсон и Борнмап считают, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной под действием БАП и 2ip происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, по мнению Чин и Ченга, для псевдотсуги - в субэпидермальных слоях; а Вилалобос и другие утверждают, что при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин, этот процесс происходит одновременно в эпидермальном и субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша. Этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез (рис. 4.5).

Основное отличие образования зародышей in vitro и in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедо-видную и в конечном счете имеют тенденцию к развитию в проросток.

Это явление впервые было отмечено в культуре клеток моркови еще в середине 50-х гг., а в настоящее время используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, а также для некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда и некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).

Образование растений путем соматического эмбриогенеза на сегментах листовых пластинок сенполии
Рис. 4.5. Образование растений путем соматического эмбриогенеза на сегментах листовых пластинок сенполии (фото Н.В. Зобовой)

Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды.

Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией.

Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, не требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, потому что соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Каллус - неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных клеток. Дедифференциация - переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации. Практически он мало используется в целях получения посадочного материала in vitro.

Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками.

Наряду с генетическими изменениями наблюдаются изменения растений и по морфологии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму.

Однако несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет свои положительные стороны и преимущества.

Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при определенных благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях.

Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости.

К таким растениям можно отнести амариллис, эписции, драцены, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены: сахарная свекла, некоторые представители рода Бразика, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен. Разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов.

В целом методы клонального микроразмножения, несомненно, имеют ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
- высокий коэффициент размножения (10 5-10 6 - для травянистых, цветочных растений, 10 4-10 5 - для кустарниковых и древесных, 104 - для хвойных);
- сокращение продолжительности селекционного процесса;
- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
- возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
- возможность автоматизации процесса выращивания.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы