Клеточные культуры для продукции белков. Дрожжевые системы экспрессии

26 Декабря в 10:55 1892 0


Клеточные культуры для продукции белков

В последнее время все больше растет потребность общества в разнообразных белковых препаратах. Особенно быстрыми темпами увеличивается применение фармацевтических белковых препаратов в диагностике и терапии заболеваний человека и животных. Это не только антитела и их производные, но многие белки из крови человека (цитокины, ростовые гормоны, интерлейкины, интерфероны и др.).

На современном рынке присутствует около ста препаратов на основе белков человека, и это количество растет год от года. Все эти белки произведены in vitro при использовании генетически модифицированных клеточных культур, полученных генно-инженерными методами, в основном это бактериальная культура E. coli, дрожжевые Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris или культуры клеток млекопитающих.

Пока наиболее экономически эффективной и хорошо охарактеризованной системой остается бактериальная. Однако благодаря прокариотическому типу данной системы эукариотические белки в ней плохо процессируются и продукция в ней ограничивается простыми структурами (пептиды, небольшие белки), где посттрансляционные модификации отсутствуют или не нужны для биологической функции.

Кроме того, высокий уровень синтеза часто приводит к аггрегациии рекомбинантных белков в виде плохо растворимых телец включения (inclusion bodies), что делает необходимым этап ренатурации рекомбинантного белка для перевода в биологически активную форму. Также необходимым этапом является удаление бактериальных токсинов, присутствующих в данной системе. При этом общая продуктивность бактериальной системы остается довольно низкой - 0,1-1,5 мг/л.

Дрожжи как эукариотический организм не имеют этих недостатков, но практический опыт показывает, что большое количество синтезируемого продукта теряется вследствие деградации целевого белка в среде. Кроме того, в дрожжах, особенно в Saccharomyces cerevisiae, гликопротеины подвергаются гипергликозилированию, в результате которого формируются N-гликаны с очень высоким содержанием маннозы, которые кардинально отличаются от N-гликанов млекопитающих или человека.

Ситуация может быть улучшена использованием метилотрофных дрожжей P. pastoris в качестве экспрессионной системы. Белковая продукция в дрожжах может достигать 6,4 г/л, но обычно находится в диапазоне 100-200 мг/л. Несмотря на эти ограничения, 43 % рекомбинантных белков, существующих на рынке, продуцируются в бактериях или дрожжах.

Большинство фармацевтических биотехнологических продуктов, однако, продуцируются в различных культурах клеток млекопитающих, например, NSO, BNK, CHO. Как типы, наиболее близкие человеческим клеткам, эти системы дают высокий уровень продукции функциональных рекомбинантных белков с корректным N-гликозилированием и другими посттрансляционными модификациями. Уровень продукции культур клеток млекопитающих приблизительно составляет 1-3 г/л. Этот «золотой стандарт» требует дорогой инфраструктуры и компонентов сред.

Кроме того, существует риск вирусной или онкогенной контаминации. Все это приводит к сверхвысокой стоимости конечного продукта, приблизительно варьирующей от 0,3 до 10 тыс. дол. США за грамм в зависимости от количества синтезируемого белка, и к необходимости искать более дешевые альтернативы продукции целевого белка, которым могут стать целые трансгенные растения или животные.

Растительные клеточные культуры. Растения всегда были основным источником биопродуктов для человека, снабжая население пищей, волокнами, древесиной и лекарствами. В области фармацевтики растения используют для получения огромного количества вторичных метаболитов с разнообразными терапевтическими эффектами: ранозаживляющие, антимикробные, противовоспалительные, психоактивные и др. Растения выработали эти субстанции в процессе эволюции, чтобы защитить себя от патогенов и хищников или привлекать опылителей.

Современные биотехнологические методы позволяют продуцировать эти продукты предсказуемым образом в клеточных культурах из соответствующих лекарственных растений. Иногда это единственный путь производить препараты в промышленных масштабах, например, когда исходное растение сложно для культивирования или очень редко встречается в природе. В качестве успешных примеров можно привести алкалоиды, паклитаксел (противоопухолевый препарат) и шиконин (антимикробный и противовоспалительный).

Растительные клетки как эукариотическая система обладают всеми чертами для продукции биологически активных сложных белков. Как результат, доля биологически активной формы в синтезированном растительными клетками рекомбинантном тотальном белке бывает очень высока. Так, например, в сравнительном исследовании экспрессии анти-CEA scFv, клетки табака синтезировали, несомненно, наибольшее количество функционально активного белка (92 %) от тотального рекомбинантного по сравнению с E. coli (12 %) и P. pastoris (40 %).

Животные клеточные культуры существуют с 50-х гг. прошлого века, когда были выделены в клеточную культуру HeLa клетки и CHO клеточная линия. Больше пятидесяти лет развития позволило производству на основе животных клеточных культур достигнуть выдающихся успехов. По данным за 2007 г. приблизительно шестая часть наиболее популярных лекарств являются биотехнологическими продуктами. Девять из десяти наиболее популярных биотехнологических лекарственных препаратов, продающихся в США, произведены в клеточной культуре клеток млекопитающих и, по крайней мере, продажи 23 белковых препаратов превышают один биллион долларов.


Дрожжевые системы экспрессии

Дрожжи являются очень привлекательный системой экспрессии, позволяющей сочетать дешевизну прокариотического культивирования с эукариотическим процессингом белков. Дрожжевая система экспрессии имеет следующие преимущества. Во-первых, дрожжи являются одноклеточным организмом, генетика и физиология которого детально изучены и который можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных культиваторах.

Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные так называемые  в-плазмиды. В-третьих, в клетках дрожжей осуществляется большое число посттрансляционных модификаций. В-четвертых, лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким образом, если гетерологичный белок секретируется клеткой, то его очистка не составит большого труда.

В-пятых, поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, Департамент по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) включил обычные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae в список «организмов, признанных безопасными». Таким образом, использование этих организмов для получения белков, применяемых в медицине, не требует дополнительных экспериментов, необходимых при работе с неразрешенными к применению микроорганизмами. Некоторые белки, синтезированные в S. cerevisiae, уже используются в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики.

В дрожжевых клетках гликозилируются только секретируемые белки, поэтому для получения рекомбинантных белков, которые для перехода в активную форму должны подвергнуться N- или О-гликозилированию, необходимо использовать системы секреции. Для этого перед кДНК, которая кодирует интересующий исследователя белок, нужно поместить так называемый пре-про-а-фактор - лидерную (сигнальную) последовательность гена а1 фактора спаривания дрожжей.

Синтезируемый рекомбинантный белок сможет в этом случае эффективно секретироваться дрожжами.

К сожалению, белки млекопитающих подвергаются избыточному гликозилированию в клетках S. cerevisiae, что сильно меняет их иммуногенность. Использование других видов дрожжей, особенно метилотрофных Pichia pastoris иногда помогает решить данную проблему.

Клетки насекомых и бакуловирусы для синтеза белков

Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе многих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются две их формы. Одна представлена отдельными вирионами, которые высвобождаются из инфицированной клетки хозяина, как правило, клетки средней кишки, и способны инфицировать другие клетки этого органа. Вторая состоит из множества вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса называется полиэдрином, а сама структура - полиэдроном.

Синтез полиэдрина начинается через 36-48 ч после инфекции и продолжается 4-5 сут, пока зараженные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инактивации их защищает белковый матрикс. Если восприимчивый хозяйский организм проглатывает такую частицу, то полиэдрин солюбилизируется и высвобождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл.

Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена.

Следовательно, замена последнего генома чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтезу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме целевого рекомбинантного белка. Исходя из этого, на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных.

Наиболее широко используется вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Этот бакуловирус инфицирует более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих клеточных линий.

Линии клеток, обычно использующиеся для работы с рекомбинантным AcMNPV, получают из гусениц Spodoptera frugiperda. Промотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка.

Так, полученный в бакуловирусной системе экспрессии поверхностный белок ВИЧ был первым белком, использовавшимся для создания вакцины против СПИДа. Но пока данная система не получила широкого распространения, вероятно, вследствие трудоемкости процедуры и высокой стоимости получаемого продукта.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы