Элементный баланс роста микробных культур

04 Января в 14:20 1001 0


Распространенная форма записи стехиометрии химической реакции и их множества такова, что субстраты (расходуемые вещества) стоят в левой части уравнения, а продукты (образуемые вещества) в правой. Например, реакция превращения 3-фосфоглицеринового альдегида в пировиноградную кислоту, состоящая из ряда стадий, имеет вид
Н2РО3-ОСН2- СНОН- СНО + NAD+ + 2ADP) + Р, = СН3-СО-СООН + 2АТР + Н2О + NADH + Н+ (7.13)
В общем виде стехиометрическое уравнение можно записать как
В общем виде стехиометрическое уравнение можно записать как(7.14)  
Здесь 1 < i < I и 1 <j <J - отдельная нумерация для субстратов Si и продуктов Pj, а соответствующие стехиометрические коэффициенты v/ (для субстратов) и vJp (для продуктов) все положительны.

Такая форма записи обладает громоздкостью, которая видна при исследовании множеств химических реакций. Одно и то же вещество может тогда быть субстратом в части реакций и продуктом в других. Чтобы избежать излишней сложности, все участники реакции переносятся в левую часть уравнения, нумеруются одной общей нумерацией, а коэффициенты считаются отрицательными для субстратов (это символизирует их убыль) и положительными для продуктов. Тогда обобщенное стехиометрическое уравнение химической реакции имеет вид
V1S1 + V2S2 + ... + VkSk = 0 (7.15)
или, в более компактной форме:
обобщенное стехиометрическое уравнение химической реакции имеет вид(7.16)
где к - номер реагента (субстрата или продукта); Sk - символическое обозначение k-го реагента; vk - стехиометрические коэффициенты; К - общее число реагентов.

Стехиометрические коэффициенты любой реакции связаны между собой законом сохранения вещества, который соблюдается для каждого химического элемента, входящего в состав реагентов. Еще одну связь добавляет закон сохранения электрического заряда, если в реакции участвуют ионы.

Стехиометрические уравнения могут относиться и к совокупности реакций. Превращение глюкозы в фруктозо-1,6-дифосфат происходит без изменения числа атомов углерода в молекуле. Затем происходит расщепление на два трехуглеродных фрагмента, и поэтому число молекул, превращающихся из 3-фосфоглицеральдегида в пируват, а затем в этанол, вдвое больше, чем число прореагировавших молекул глюкозы. Учитывая последнее обстоятельство, сложение стехиометрических уравнений всех реакций дает итоговое уравнение так называемой брутто-реакции:
С6Н12О6 (глюкоза) + 2АДР = 2С2Н6O(этанол) + 2СО2 + 2АТР (7.17)
При этом предполагается, что движение вещества по всему пути происходит жестко - сколько молекул, например, фруктозо-1,6-дифосфата образовалось, столько же и употребилось в следующей реакции, и не происходит ни накопления, ни истощения пула каждого интермедиата (промежуточного метаболита). В действительности же в любом метаболическом пути все пулы «дышат», концентрации интермедиатов испытывают колебания, либо периодические, либо случайные, либо то и другое одновременно.

Поэтому стехиометрия, описываемая брутто-уравнением типа (7.17), справедлива, если рассматриваются количества вещества, прошедшие по данному пути за достаточно большое время, например, значительно превышающее период колебаний интермедиатов. Тогда, поскольку концентрации интермедиатов ограничены, количество вещества, прошедшее через весь метаболический путь, значительно превышает количество вещества, остающееся в промежуточных соединениях.

Вышесказанное позволяет рассматривать рост биомассы и образование продуктов метаболизма как большую брутто-реакцию. Ее балансирование по химическим элементам и, если нужно, по электрическому заряду, дает возможность найти связи между различными стехиометрическими коэффициентами при росте клеточных популяций. Этот подход явился стартовой позицией для разработки новых принципов и расчетных методов материально-энергетического баланса роста клеточных популяций. Задача баланса сводилась к следующему.

Имеется несколько величин, характеризующих эффективность роста микроорганизмов. В простейшем случае аэробного роста, когда образование органических продуктов незначительно или вообще отсутствует, это два коэффициента - YX/S - выход биомассы из органического субстрата, водорода и т.д. и Гх/о - выход биомассы из потребленного кислорода.

Субстрат является источником вещества и энергии для роста, а кислород связан с процессом извлечения клетками энергии из субстрата для использования в метаболизме при преобразовании субстрата в биомассу. Поэтому каждый из двух выходов представляет интерес. Возникает вопрос о взаимосвязи этих величин. При наличии такой связи можно ограничиться изучением одной из них, а именно, той, которую легче измерять, а другую при необходимости вычислять из первой.

В связи с этим интересен элементный баланс для весьма распространенного в природе и биотехнологии процесса - гетеротрофного аэробного роста микроорганизмов, когда в качестве источника азота используется аммиак. Этот случай интересен также потому, что азот в NН3 находится в том же электронном состоянии, в котором находится почти весь азот биомассы. Элементный состав сухого вещества биомассы, состав органического субстрата и возможного органического продукта в общем виде записывается следующим образом: СНmО1 (субстрат), СНpОnNq (биомасса), CHrOsN1 (продукт).

Углерод органического субстрата расходится в трех направлениях -в биомассу, в органический продукт (если он образуется) и в СО2. Выходы (по углероду) биомассы и продукта - ух/5 и ур/8. Каждая из этих величин есть доля углерода субстрата, включенная в вещество биомассы и продукта. Тогда процесс преобразования вещества субстратов при росте культуры с позиции перераспределения атомов химических элементов записывается в следующем виде:
Тогда процесс преобразования вещества субстратов при росте культуры с позиции перераспределения атомов химических элементов записывается в следующем виде(7.18)
Значения и yp/s не фиксированы. В зависимости от микроорганизма и условий культивирования они могут меняться в пределах от нуля до некоторого максимума.

В уравнении (7.18) присутствуют пять коэффициентов: а, b, с, уx/s, yp/s. Имеются четыре условия сохранения числа атомов химических элементов С, Н, О, N, из которых условие для углерода уже учтено. Остальные условия дают выражение а, b, с через С и yp/s:
меются четыре условия сохранения числа атомов химических элементов С, Н, О, N, из которых условие для углерода уже учтено. Остальные условия дают выражение а, b, с через С и yp/s
Величины Ys, YВ, YP играют важную роль в материально-энергетическом балансе микроорганизмов и живой материи.

Они являются мерой восстановленности углерода, соответственно, органического субстрата, биомассы и органического продукта. Это можно видеть из правых частей уравнений (7.22)-(7.24), учитывают число атомов С, Н, О, N в составе каждого вещества: 4 - число электронов внешней оболочки атома углерода, каждый атом водорода добавляет по одному электрону, а кислород и азот (выступающий как окислитель в МНз) отнимают от этих электронов, соответственно, по 2 и 3. Эти величины послужили отправным пунктом дальнейшего развития исследований, приведших к разработке метода материально-энергетического баланса.


Величины а, b и с описывают расход аммиака и кислорода и образование метаболической воды при росте культуры. Чтобы найти их численные значения, необходимо задать выходы биомассы и продукта по углероду yx/s и yp/s, а также ys, уВ, ур. Значения и yv/s зависят от вида клеток и от условий культивирования.

Для часто встречающегося случая, когда образование органических продуктов отсутствует или незначительно, yp/s = 0. Поскольку молекулярная масса кислорода равна 32, а сухая масса клеток в правой части (7.18), то расход кислорода на единицу образованной биомассы равен:
расход кислорода на единицу образованной биомассы равен(7.25)

Согласно анализу (7.25) для каждого значения ys имеется такое, при котором расход кислорода становится равным нулю, а при более высоких делается отрицательным. Однако это означало бы, что при каких-то режимах гетеротрофного роста кислород мог бы выделяться, как при фотосинтезе. Поскольку такие процессы неизвестны, это предположение выглядит неправдоподобным. Очевидно, что строгое решение вопроса о максимально допустимом значении выхода по углероду требует совместного рассмотрения баланса вещества и баланса энергии.

В связи с этим степень восстановленности является величиной, которая несет в себе связь балансов вещества и энергии. Чтобы понять ее смысл, рассматривается уравнение окисления органического вещества кислородом: СНОН + 02 — С02 + Н20 + МН3. Здесь СНОН может быть индивидуальным органическим соединением либо их смесью, в том числе биомассой клеток. После сбалансирования это уравнение имеет вид
После сбалансирования это уравнение имеет вид(7.26)
где у - выражение, идентичное ys, уВ, ур. Если окисление происходит чисто химическим путем, то весь запас энергии органического вещества превращается в тепло. При биохимическом окислении с участием электронтранспортных путей часть энергии сохраняется в промежуточных носителях, а затем используется клеткой. Таким образом, процесс (7.26) является способом оценки общего количества биологически доступной энергии, заключенной в органических веществах.

Поскольку, согласно (7.26), количество потребленного кислорода пропорционально Y, а выделившаяся энергия пропорциональна кислороду (с приблизительно постоянным коэффициентом), то Y оценивает запас энергии вещества СНОН  в расчете на один грамм-атом его углерода.

Наиболее полное использование энергии субстрата имеет место при участии электронтранспортной цепи с кислородом как терминальным акцептором. Каждая молекула О2 имеет 4 вакантных места для присоединения электронов других атомов и образования СО2 и Н2О. Тогда 1/4О2 есть количество свободного кислорода, пересчитанное на одно такое вакантное место, т.е. на один электрон, присоединяемый свободным кислородом. Схема (7.26) не рассматривает детали процесса преобразования энергии в электронтранс-портных цепях, она предназначена лишь для оценки энергетического запаса субстрата окисления и отражает формальный подход.

В связи с этим введена система отсчета термодинамических потенциалов. Нулевые значения энтальпии и свободной энергии образования прописаны в ней следующим базисным веществам: Н+, НСО-з, Н2О, NH+4, Н2РО4-, HS, Fe и другие ионы металлов и галогенов. Все эти вещества взяты в водном стандартном состоянии. Таким образом, вышеназванные вещества являются естественным энергетическим нулем клеточного метаболизма, который достигается при биологическом окислении органических веществ.

Для того, чтобы физиологический базис был полным, в него введен свободный кислород. Тогда реакция образования любого соединения выглядит как сложение вышеупомянутых базисных веществ со стехиометрическими коэффициентами, а затем вычитание из полученного результата соответствующего количества О2.

Например, глюкоза: С6Н12О6 = 6НСО3- + 6Н+ - 6О2. С позиции векторного формализма знак «-» перед членом линейной комбинации означает присутствие отрицательного слагаемого. С физико-химической точки зрения вычитание кислорода означает восстановление базисных веществ, т.е. придание нового свойства. Поэтому для придания этому подходу логической завершенности заменено вычитание кислорода вложением специфического базисного вещества - 1/4О2, названного «редоксон».

Указанный коэффициент служит для пересчета количества кислорода на один электрон, акцептируемый О2 в процессе, обратном реакции образования химического соединения в физиологическом базисе (при окислении его свободным кислородом до веществ физиологического базиса - НСО-3, Н20, NH+4, Н2РО4- и т.д.). Тогда реакция образования, например, глюкозы в физиологическом базисе имеет вид: С6Н12О6 = 6НСО3- + 6Н+ - 24RO, где понятие физиологический базис - это альтернативная система отсчета для элементного состава химических соединений.

Задание числа редоксонов определяет с абсолютной точностью количество вещества в виде
Задание числа редоксонов определяет с абсолютной точностью количество вещества в виде
где М - масса данного количества вещества; № - число редоксонов; aRO и Y - восстановленность вещества (число RО на молекулу и на один атом углерода соответственно); МГ°1 - молекулярная масса; а - доля углерода в массе вещества.

Расчет величин aR0 и RO и их значения представлены в работе.

Зависимость (7.27) применима к любым индивидуальным соединениям, в том числе и не содержащим углерод. Формула (7.28) применима исключительно к углеродсодержащим веществам, однако не только к индивидуальным соединениям, но и к любым их смесям, в том числе к биомассе клеток.

Если ввести средний уровень энергии в виде HRO, то количество энергии, прошедшее с потоком вещества через данную реакцию, определяется равенством:
H ~ NRO HRO
В связи с этим рассмотрение потоков вещества и энергии может быть сделано совместно, если измерять количество вещества в числах RO. Таким образом, баланс редоксонов является материально-энергетическим балансом клеточного метаболизма:
ANS + AN02 = ANB + ANP.
Из закона сохранения - количество редоксонов, входящих в метаболизм, равно числу RO, выходящих из него, вытекает:
ANs = ANb + ANp + ANres, (7.29)

где индексы S, О2, В и Р относятся, соответственно, к органическому субстрату, кислороду, биомассе и продукту метаболизма.

Под продуктами метаболизма подразумеваются вещества, образуемые клетками и обладающие восстановленностью в физиологическом базисе. Это в большинстве случаев органические вещества, но это может быть также и водород.

Уравнение (7.29) является универсальным для всех микроорганизмов, использующих химические соединения в качестве субстрата - источника восстановленности для роста. Оно описывает не только аэробный метаболизм при росте на органическом субстрате. В случае анаэробного брожения ANRES = 0. В случае анаэробного дыхания ANRES есть число электронов, которые акцептируются веществом, иным, чем кислород (например, нитрат). В случае хемолитотрофного метаболизма ANS есть число редоксонов неорганического субстрата.

Уравнение (7.29) описывает перераспределение вещества и энергии в процессе метаболизма. Оно рассматривает метаболизм с точки зрения его входов и выходов. Соотношение между членами правой части (7.29) зависит от особенностей метаболизма, которые определяются видом организма, видом субстрата и совокупностью условий роста.

Учет этих факторов позволил получить  дополнительные связи между большими метаболическими потоками, идущими в биомассу, на кислород и в восстановленные продукты.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы