Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку

26 Декабря в 10:29 3825 0


В настоящее время известно около 40 различных способов доставки рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Пока не существует единой классификации методов доставки рекомбинантной ДНК в клетки. Каждый автор обзоров классифицирует по-своему, возможно, потому, что для многих эмпирически найденных методов механизм преодоления мембраны не ясен до сих пор, например для трансформации. С терминологией также существует неопределенность, что неудивительно для бурно развивающейся новой области науки и практики.

Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. Ниже подробно рассмотрены некоторые наиболее известные способы доставки ДНК в клетки-мишени.

Трансформация в самом общем значении - это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин.

По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК,
при этом составляет примерно 10000 - 10000000 . Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны.

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля этих клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто используемый этап подготовки компетентных клеток получение сферопластов - клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки.

Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.

Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и рецепиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. При этом конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке.

Таким образом можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Например, показан мобилизационный перенос челночного вектора pAT187 с широким кругом хозяев из E. coli в различные грамположительные бактерии (родов Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), хотя и с намного меньшей эффективностью, чем для переноса между разными штаммами E. coli.

Более того, недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных. В процессе конъюгации переносится только одна цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается атаке хозяйских рестриктаз. Эффективность этого метода для бактерий сопоставима с трансформацией.

Вирусная инфекция. Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина, который зависит от типа вируса.

Перфорационные методы. Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клетки-мишени является электропорация - временное создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Является универсальным физическим методом трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток.

При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами составляет 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации повышается до 109-1011 для малых плазмид (~3-6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС.

Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12-18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см. Электропорация - наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора.

Другие перфорационные методы доставки ДНК в клетку: обработка клеток ультразвуком, соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенного материала, центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией, осмотическая перфорация плазматической мембраны, пробой клетки лазерным микролучом, использование порообразующего токсина стрептолизина-О.

Трансфекция. Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот. Термин «трансформация», обозначающий процесс введения ДНК в клетку для прокариот и дрожжей, оказалось, использовать неудобно, поскольку применительно к животным клеткам трансформация - это превращение нормальных клеток в раковые. В узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов.

Одним из первых разработанных методов эффективной трансфекции была инкубация ДНК с ДЕАЕ-декстраном. Полученная эффективность была сопоставима с трансформацией бактерий и достигала 106 трансфектантов на мкг ДНК.

Механизм действия ДЕАЕ-декстрана окончательно не установлен, но известно, что он связывается с ДНК и с клеточной мембраной, стимулируя пиноцитоз (рис. 2.8), хотя сам клетками не захватывается. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕ-декстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту получения стабильных трансфектантов.

Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза
Рис. 2.8. Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематичное изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется катионным полимером (б)

Эффективность трансфекции удалось повысить в 10-100 раз инкубацией клеток с осажденной фосфатом кальция ДНК. Плотные частицы кальциевого преципитата ДНК поглощаются клеткой путем фагоцитоза (рис. 2.8), но при этом только небольшая часть проникших молекул достигает ядра и встраивается в хромосомную ДНК. Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально.

В ходе поисков других трансфецирующих реагентов было выявлено, что полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность трансфекции. Полимерные катионы образуют с нуклеиновыми кислотами устойчивые комплексы с нейтрализованными зарядами, которые могут с высокой эффективностью транспортировать ДНК и РНК внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз на пути к ядру (рис. 2.9).

Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза


Рис. 2. 9. Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза

Синтетические нелипидные полимерные катионы в линейной или разветвленной конформации (дендритная форма) могут конденсировать ДНК и РНК в относительно малые частицы, которые затем связываются с клеточной мембраной и проникают в клетку путем неспецифического эндоцитоза. В настоящее время для трансфекции из группы нелипидных поликатионов используются в основном полиэтиленимин, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные белки типа полилизина, протамина и гистонов, а также различные коммерческие продукты, например PAMAM.

Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером (Feigner, 1987) с соавторами. Эффективность трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток.

Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного ли-пидного полимера (б)
Рис. 2. 10. Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного ли-пидного полимера (б). Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных липосом (а) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть

Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам.

Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.).

Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК.

Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в структуру липосом фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, способные инициировать слияние мембран.

Липосомный метод достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эффективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, обычно обработка ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК.

Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза (см. рис. 2.9).

В качестве таких лигандов используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины -белки-рецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)-трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.

В настоящее время биотехнологические фирмы предлагают широкий спектр разнообразных трансфекционных реагентов - от самых простых и дешевых до самых последних разработок, специализированных под разные типы клеток и задачи. Также интенсивно продолжается создание новых еще более эффективных трансфецирующих реагентов.

Микроинъекция - клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1-0,5 мк и микроманипулятора. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Баллистическая трансфекция, биобаллистика, или биолистика (бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1 -2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные синтетические наносферы. Микрочастицы, покрытые ДНК, проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в органеллы и ядра клеток. Созданный для этой цели «генный пистолет» (gene gun), или «генная пушка», который был разработан Д. Сенфордом (J. Sanford) в 1987 г. для введения ДНК в зерна хлебных злаков, по своему устройству сходен с пневматическим оружием (рис. 2.11).

Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б).
Рис. 2.11. Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б). Гелиевый импульс выбрасывает микрочастицы, покрытые ДНК или РНК, из капсулы с образцом. Микрочастицы, несущие ДНК, ускоряются и фокусируются для максимального проникновения в клетки, продвигаясь по разгоночному каналу и по стволу пистолета, при этом на широком выходе поток гелия диффузно расходится в стороны. Фильтр-спейсер поддерживает оптимальную дистанцию для поражения цели с максимальным удалением гелия, чтобы свести к минимуму повреждающие воздействия на поверхность клеток

Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика - до 1 мм, однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений.

Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные высокоэффективные и безопасные средства генной доставки.

Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку. После введения рекомбинантной ДНК в эукариотическую клетку, лишь ее малая часть оказывается в ядре, поскольку ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для чужеродной ДНК. В ядре рекомбинантная ДНК может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии.

Соответственно, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой молекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время. Стабильное наследование внедренной чужеродной ДНК - основное условие получения трансгенных организмов для хозяйственных целей.

Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы