Процессы в биотехнологии: постферментационная стадия, фракционирование экстрактов биомассы

24 Декабря в 21:17 3933 0


Постферментационная стадия

Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой товарной продукции и также обезвреживание отходов и побочных продуктов. Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотребленные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира и пузырьки воздуха.

В свою очередь, водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое количество органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости - до 17 % и более, содержание биомассы в культуральной жидкости достигает 8-10 %. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1,5 %, что составляет менее 10 % сухого остатка.

В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.), локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру, методы выделения и очистки (рис. 2.3). Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках.

Возможные способы выделения целевого продукта
Рис. 2.3. Возможные способы выделения целевого продукта

Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы - биомассы. Наиболее распространенный метод для этих целей - сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах - сепараторах, которые работают по различным схемам, в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости.

Основные проблемы возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц размером 0,5-1,0 мкм и менее (бактериальные клетки) и переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка). Для повышения эффективности процесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры - изменение pH, нагревание, добавление химических агентов.

Фракционирование экстрактов биомассы

Полученные с помощью биосинтеза (ферментации) продукты всегда оказываются в сложной смеси с другими продуктами жизнедеятельности той же биосинтетической системы, будь то культура клеток микробов, клеток животных или растений или даже целый организм. Важнейшей задачей биотехнологии является очистка целевого продукта из этой сложной смеси. Целевой продукт может находиться либо внутри клетки, либо вне ее - в культуральной жидкости.

Отделяя клеточную массу от культуральной жидкости, мы частично обогащаем целевой продукт, удаляя из содержащей его смеси соответствующие компоненты - внеклеточные или внутриклеточные соответственно. Однако сложность смеси, в которой оказывается продукт, остается все еще высокой. В случае если он находится внутри клеток, последние необходимо разрушить, после чего мы переходим к фракционированию многокомпонентного раствора; если же мы имеем дело с внеклеточным продуктом, то сразу можем приступать к фракционированию раствора, что, по сути, является первым этапом очистки целевого продукта. Эта задача является фактической задачей на разделение суспензии и имеет несколько вариантов инженерного решения.

Разделение суспензий. Одним из способов разделения суспензий является седиментация - разделение культуры как дисперсной системы на дисперсную фазу и дисперсионную среду (в нашем случае - клетки продуцента и культуральную жидкость). Разделение фаз в простейшем случае может быть достигнуто длительным отстаиванием, в процессе которого клетки продуцента, отличающиеся по плотности от культуральной жидкости, рано или поздно либо выпадут в осадок, либо всплывут.

Однако при осуществлении биотехнологических процессов образуются системы, в которых дисперсная фаза состоит из мелких частиц, мало отличающихся по плотности от дисперсионной среды. Кроме того, поскольку мы имеем дело с живой системой, в которой продолжаются биохимические системы, возможно понижение концентрации целевого продукта за счет деградации его клеточными ферментами. Все это приводит к необходимости ускорить процесс разделения системы. Для этого используют центрифуги (центрифугирование).

С их помощью можно решить следующие технологические задачи:
- разделение суспензии на осадок и раствор;
- разделение эмульсий на две жидкие фазы различной плотности.

Центрифуги используют как в лабораториях, так и в промышленном производстве. Лабораторные центрифуги представляют собой аппараты периодического действия, в которые загружается определенное количество разделяемой смеси, производят в заданных условиях процесс разделения, останавливают и выгружают жидкую фазу и осадок. В промышленности чаще применяют центрифуги непрерывного действия, позволяющие перерабатывать за один цикл объемы разделяемой смеси, значительно превышающие вместимость ротора.

Скорость осаждения можно регулировать путем подбора соотношения плотностей дисперсной фазы и дисперсионной среды. Одним из вариантов использования этого принципа является центрифугирование в градиенте плотности растворителя. Для этого в состав растворителя вводят компонент, дающий растворы высокой плотности. Чаще всего используются сахароза, некоторые специальные полимеры (фиколл -сополимер сахарозы и эпихлоргидрина, перколл - коллоидные частицы силикагеля, покрытые поливинилпирролидоном) или растворы солей (CsCl, Cs2SO4, CsI и другие соли цезия).



Другие способы разделения суспензий. Клетки микроорганизмов можно просто отфильтровать от культуральной жидкости, что и используется при стерилизации питательных сред. Но если при стерилизации требования к содержанию микробных клеток в фильтрате очень высоки, то при отделении клеток от культуральной жидкости, после выращивания микробной культуры, эти требования гораздо ниже. Эти обстоятельства позволяют использовать при фильтрационном разделении технологической культуры материалы более грубые по размерам пор, но обладающие высокой механической прочностью и пропускной способностью.

К такого рода материалам относится, в частности, ткань Петрянова (по имени советского ученого-химика). Для осуществления фильтрации применяется специальная аппаратура - вакуумные фильтры барабанного типа, фильтр-прессы, на которых фильтрация идет под давлением. Существуют также фильтрующие центрифуги, в которых центробежная сила используется для продавливания жидкости через слой фильтрующего материала.

В некоторых случаях при разделении микробных суспензий используют технику флотации, когда в культуру добавляют относительно небольшое количество несмешивающейся с водой жидкости в мелко раздробленном состоянии. На поверхности раздела капелек этой жидкости и воды сорбируются клетки культуры, и после расслаивания эмульсии микробную массу удается сконцентрировать.

Разрушение клеточной массы (дезинтеграция)

Для извлечения целевых продуктов, находящихся внутри клетки микроорганизма или при получении продуктов из тканей животных или растений, необходимо прежде всего разрушить их или осуществить процедуру дезинтеграции.

Дезинтеграция клеточной массы представляет собой один из важнейших элементов биотехнологического процесса. Эту процедуру осуществляют физическими, химическими или ферментативными методами.

Наиболее распространенными в промышленности являются физические методы, среди которых чаще всего применяют баллистические методы дезинтеграции. Сущность этой группы методов состоит в том, что биомассу подвергают воздействию удара или истирания. В первом случае биомассу помещают в цилиндрический барабан, вращающийся вокруг оси и наполненный шариками из тяжелого твердого материала (металл или фарфор).

При вращении барабана шарики перекатываются и ударяют по агломератам биомассы, причем удары происходят достаточно часто и в разных направлениях. Это приводит к разрушению клеточных стенок и получению однородного вязкого раствора, в котором находится содержимое клеток.

Однако следует учитывать, что в ходе такой обработки содержимое барабана существенно нагревается от соударений. Учитывая термолабильность компонентов клетки, это тепло необходимо удалять, что достигается введением в конструкцию дезинтегратора теплоотводящих элементов. Обычно это рубашка (кожух, в который помещают барабан), через которую пропускают холодную воду или другой хладоагент. Степень дезинтеграции (доля разрушенных клеток) за один цикл составляет 52-85 %, в зависимости от вида подвергаемой обработке биомассы.

Ход дезинтеграции можно описать уравнением
Ход дезинтеграции
где А - степень дезинтеграции, %, К - константа скорости дезинтеграции, f -объемная скорость, л/час.

Другим способом механической дезинтеграции клеток является экструзия. Сущность этого метода заключается в том, что суспензию клеточной массы под высоким давлением продавливают через узкое отверстие в камеру с нормальным давлением. При этом из-за большого перепада давления вода, которая попала в клетки, быстро выходит из них и при этом разрушает клеточную стенку. Кроме этого происходит разогрев и также необходимо охлаждение во избежание потерь продукта из-за термоинактивации. Степень разрушения клеток при таком способе составляет до 90 %.

Ультразвуковая дезинтеграция. Помимо механических способов используются приемы, основанные на воздействии на клетки ультразвука. Под действием ультразвукового поля клетки испытывают попеременные сжатия и растяжения, скручивание в различных направлениях, что, в конце концов, приводит к разрыву клеточной стенки и ее разрушение.

Как и в случае баллистических методов, операция дезинтеграции с помощью ультразвука может осуществляться как в периодическом, так и в непрерывном режимах. Для этой цели сконструированы специальные ячейки, позволяющие прокачивать суспензию разрушаемой биомассы со скоростью нескольких литров в минуту при концентрации клеток в суспензии до 20 % и поддерживать при этом температуру 2-4 С. Для более полного разрушения биомассу можно возвращать в цикл.

Химические методы разрушения клеток. Как различные методы механической дезинтеграции, так и ультразвуковая дезинтеграция биомассы основаны на использовании механического разрыва клеточной оболочки - либо ее абразивное разрушение, либо разрыв ее за счет осмотических сил.

В ряде случаев более удобным оказывается разрушение клеточной оболочки за счет перевода в раствор отдельных ее компонентов, т. е. изменения ее состава и структуры, что делает ее более проницательной для клеточного содержимого.

Одним из таких методов является детергентный лизис клеток. Биомасса продуцента в этом случае обрабатывается каким-либо из детергентов, который растворяет липидные компоненты клеточной стенки, после чего внутриклеточные компоненты через образовавшиеся поры вытекают в окружающую среду.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы