Процессы в биотехнологии: фракционирование экстрактов биоматериалов

24 Декабря в 21:19 1614 0


Фракционирование экстрактов биоматериалов

Существует несколько подходов к фракционированию смесей. Один из низ - неспецифический, когда, располагая ограниченной информацией о свойствах продукта, мы проводим его через ряд последовательных стадий технологического процесса в надежде, что на каждой из этих стадий удастся реализовать какие-либо различия в свойствах целевого продукта и сопутствующих ему веществ.

В принципе, можно утверждать, что всегда найдется такая комбинация приемов фракционирования, которая позволит получить целевой продукт в достаточно очищенном состоянии, однако, следует иметь в виду, что каждая технологическая стадия сопровождается неизбежными потерями продукта, и если число таких стадий будет велико, то выход конечного продукта окажется низким, что приведет к его удорожанию и снижению экономических показателей процесса.

Второй подход основан на большем объеме информации о продукте и, следовательно, на подборе специфических для него приемов фракционирования. Таким путем можно сократить затраты на процесс производства, повысить выход продукта и экономичность технологии, но это потребует больших затрат на разработку процесса.

Основные принципы фракционирования сложных смесей удобно рассмотреть на неспецифических процедурах.

Солевое фракционирование
Этот тип фракционирования основан на различии растворимости продукта в солевых растворах различной концентрации. Обычно для этих целей применяют сульфаты, фосфаты натрия, калия и аммония. К суспензии биомассы добавляют 10 %-й раствор сульфата аммония, при этом наименее растворимые побочные продукты (обычно белки) выпадают в осадок, их отделяют центрифугированием и добавляют следующую порцию сульфата аммония 20 %-й концентрации, после чего получают второй осадок, т. е. продолжая эту процедуру получают ряд фракций, в которых содержание целевого продукта значительно выше, чем в других фракциях.

Точно таким же образом можно фракционировать суспензии добавлением органических растворителей, постепенно увеличивая их концентрацию. Чаще всего в качестве осадителей используют этанол и ацетон. Можно также применять метанол, изопропанол, диоксан, этил-ацетат и др., однако при использовании органических растворителей становится крайне важным соблюдение норм техники безопасности и пожарной безопасности, так как органические растворители токсичны и горючи. Это требует использования оборудования во взрывозащищенном исполнении, эффективной вентиляции и применения средств индивидуальной защиты.

Осаждение продуктов органическими полимерами Помимо солей и органических растворителей агрегацию белков в растворах вызывают и ряд нейтральных высокомолекулярных соединений. Однако растворы полимеров обычно имеют повышенную вязкость, поэтому для целей фракционирования используют полимеры, образующие растворы с минимальной вязкостью. Среди таковых наиболее удобными оказались полиэтиленгликоли (М.м. 4000-6000). Растворы полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 имеют небольшую вязкость, вплоть до концентрации 20 вес %.

Полиэтиленгликоль, в частности, используется для фракционирования плазмы крови. Первым из плазмы крови при добавлении полиэтиленгликоля выпадает фибриноген - крупный белок с ассиметрическими молекулами; далее осаждаются гамма-глобулины и другие компоненты.

В случае полимеров определенные проблемы возникают при их отделении от целевых белков. Обычно это осуществляется с помощью гель-фильтрации на молекулярных ситах типа Сефадекс и т. п. либо путем осаждения белка из раствора солью так, чтобы полимер при этом остался в растворе. Полиэтиленгликоль солевому осаждению практически не препятствует.

Тонкая очистка продуктов биотехнологического процесса

Рассмотренными методами можно получить относительно грубо очищенные препараты со степенью очистки целевого продукта 5-10. Для многих целей такой очистки оказывается достаточно и этим следует пользоваться, так как простые по технологии процедуры с использованием дешевых реагентов приводят к получению препаратов с низкой себестоимостью.

Однако иногда возникает необходимость получения высокоочищенных препаратов (например, получение продуктов для применения в медицине в качестве лекарственных или диагностических средств, а также для исследовательских целей в области молекулярной биологии, биохимии, биоорганической химии и т. д.).

При разработке процессов получения высокоочищенных биопрепаратов используются процедуры тонкой очистки, большая часть которых заимствована из лабораторной практики. Здесь, однако, нужно обратить внимание на следующее: лабораторные процессы получения высоко-очищенных препаратов разрабатывались для получения одного целевого продукта без учета возможностей использования экстракта биомассы для извлечения других полезных продуктов.

Таким образом, разработка технологического процесса получения целевого продукта в высокоочищенном состоянии в настоящее время чаще всего осуществляется путем случайного подбора процедур фракционирования. Какой-либо обобщенной концепции конструирования такого рода технологических процессов в настоящее время не существует.



На рис. 2.4 представлено условное отображение типичной процедуры очистки продукта в обобщенных координатах: логарифм степени очистки (lgpf) - порядковый номер технологической стадии.

Обобщенное представление технологического процесс
Рис. 2.4. Обобщенное представление технологического процесса

Процесс может быть разделен условно на три фазы: стадии 1 и 2 -грубое фракционирование, стадии 3 и 4 - основная очистка, стадия 5 - финишная очистка.

Грубое фракционирование обычно включает разрушение клеточной массы и отделение целевого продукта (например, белка) от остальных компонентов экстракта (нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов). Цель этих процедур - облегчение последующего фракционирования. Как правило, на этой фазе технологического процесса значительного обогащения целевого продукта не достигается.

Вторая фаза очистки обеспечивает отделение целевого продукта от основной массы компонентов той же природы (в нашем случае - белков). Здесь используются наиболее существенные отличия в физико-химических свойствах целевого продукта от остальных белковых компонентов разделяемой смеси. За счет этих различий и достигается очистка.

На последней фазе, в которую вступает зачастую почти индивидуальный в химическом смысле целевой продукт, осуществляется его отделение от микропримесей других компонентов, близких по свойствам к целевому продукту.

Очевидно, что и на этой стадии существенного обогащения продукта также не достигается, однако очень часто процедуры, используемые на этом этапе процесса самым существенным образом сказываются на качестве продукта.
Специфичность стадий технологического процесса

Проанализируем вторую фазу процесса - фазу основной очистки. Обычно на этом этапе используются в различных комбинациях одни и те же основные приемы фракционирования биологических экстрактов: фракционное разделение, хроматографическое разделение, препаративный электрофорез и т. д.

В реальных процедурах очистки выход высокоочищенного продукта обычно невысок и редко превышает 20 % от его содержания в исходной биомассе. Процессы являются многостадийными. Легко подсчитать, что даже при выходе целевого продукта на каждой стадии ~80 % (что является довольно высоким показателем), при последовательном применении таких шести стадий общий выход выделяемого продукта составит 25 %.

Трудоемкость и относительно большое число стадий обусловлено их низкой эффективностью.

Для характеристики эффективности стадии фракционирования используется количественный показатель - коэффициент специфичности технологической стадии. Его определяют как степень обогащения целевого продукта на данной стадии:
коэффициент специфичности технологической стадии
где pi+1 и pi - степень очистки продукта на стадии и i-стадии соответственно.

Можно условиться, какую специфичность считать высокой, а какую - низкой. Учитывая, что большинство процедур разработано для очистки ферментов, проведем рассуждения в применении к этим продуктам.

Содержание фермента в клетке обычно составляет 0,1 - 1 % от общего содержания белкового материала, следовательно, для получения индивидуального фермента его необходимо обогатить в 100-1000 раз по сравнению с исходным клеточным экстрактом. Процедуру считают удовлетворительной, если требуемая степень очистки достигается за три стадии фракционирования.

При этом необходимо, чтобы коэффициент специфичности каждой из этих стадий был более пяти. Именно такие стадии считаются специфичными. Понятно, что использование в технологическом процессе лишь специфических стадий приведет к снижению трудоемкости процесса, сокращению потерь продукта и в целом к повышению эффективности технологии и снижению себестоимости продукта.

К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный материал по различным методическим приемам фракционирования клеточных экстрактов, среди них значительное число специфичных стадий фракционирования. В процессах тонкой очистки целевых продуктов специфические стадии фракционирования используются весьма широко. Наиболее распространенным вариантом является хроматография.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы