Производство вторичных метаболитов: получение различных препаратов

25 Декабря в 13:27 6577 0


Полусинтетический способ получения пенициллинов

В настоящее время большое значение имеет так называемый полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина, обладающих рядом ценных свойств. Исходным продуктом в синтезе служит 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК)
Исходным продуктом в синтезе служит 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК)
Кислоту получают в результате биосинтеза, при развитии штамма плесени Penicillium chrysogenum, в специфических условиях его культивирования (при отсутствии предшественников в среде) или чаще путем ферментативного дезацилирования бензилпенициллина с участием пенициллинацилазы. При этом образуется 6-АПК и фенилуксусная кислота.

Ацилированием аминогруппы 6-АПК получен ряд новых полусинтетических антибиотиков, которые кислотоустойчивы в желудке, не подвергаются деструкции в организме пенициллиназой, обладают более широким спектром действия:
Ацилированием аминогруппы 6-АПК получен ряд новых полусинтетических антибиотиков, которые кислотоустойчивы в желудке, не подвергаются деструкции в организме пенициллиназой, обладают более широким спектром действия
В табл. 4.1 приведены наиболее полусинтетические пенициллины.

Химический синтез природного бензилпенициллина был проведен в 1957 г. Дж. Шееном с сотрудниками, однако он был многостадиен, давал низкий выход бензилпенициллина и поэтому не нашел практического применения.

Таблица 4.1. Полусинтетические пенициллины
Полусинтетические пенициллины

Получение цефалоспоринов

Цефалоспорины относятся к группе Р-лактамных антибиотиков, близких по структуре к пенициллину. Основной продуцент этого антибиотика - гриб Cepholosporium acremonium:
Основной продуцент этого антибиотика - гриб Cepholosporium acremonium
Цефалоспорин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, но антибиотическая активность гораздо ниже, чем у пенициллина. Структура Р-лактамного кольца его также неустойчива, и гидролизуется ферментом цефалоспориназой.

Полусинтетические аналоги цефалоспорина В последнее время методом смешанного (биологического и химического) синтеза получено большое число аналогов цефалоспорина. Многие из этих соединений имеют важное практическое значение.

Основой полусинтеза цефалоспоринов служит 7-амино-цефалоспорановая кислота, которая получается в результате отщепления ацильного остатка от цефалоспорина С под действием фермента ацилазы. Модификация основного ядра цефалоспорина может происходить с двух сторон молекулы:
Модификация основного ядра цефалоспорина может происходить с двух сторон молекулы
Химическим или биотехнологическим (ферментативным) путем можно отщепить правую ацетоксигруппу (-ОСОСН3) 7-аминоцефалоспорановой кислоты с образованием 7-аминодеацетоксицефалоспорановой кислоты и на ее основе синтезировать полусинтетические антибиотики, широко применяемые в медицинской практике.

Общая формула полусинтетических цефалоспоринов
Общая формула полусинтетических цефалоспоринов
В табл. 4.2 приведены некоторые медицинские препараты, полученные на основе полусинтетических цефалоспоринов.

Таблица 4.2. Некоторые медицинские препараты, полученные на основе полусинтетических цефалоспоринов
Некоторые медицинские препараты, полученные на основе полусинтетических цефалоспоринов

Модификация молекулы цефалоспорина приводит к существенным изменениям антимикробных свойств: расширению спектра антимикробного действия, увеличению устойчивости антибиотиков к лактама-зам, повышению липофильных свойств веществ, что дает возможность использовать их в таблетках.

Получение стрептомицина Ярко выраженной способностью вырабатывать антибиотические вещества обладают, помимо плесеней и микробов, также и лучистые грибки - актиномицеты, обычно обитающие в почве. Сравнительно быстрая гибель большинства патогенных микробов при попадании в почву тесно связана с явлением антагонизма актиномицетов и бактерий.

Изучение этого явления привело к открытию в 1943 г. С. Ваксманом второго после пенициллина антибиотика - стрептомицина, устойчивого не только к грамположительным, но и к грамотрицательным, и кислотостойким бактериям:
Изучение этого явления привело к открытию в 1943 г. С. Ваксманом второго после пенициллина антибиотика - стрептомицина, устойчивого не только к грамположительным, но и к грамотрицательным, и кислотостойким бактериям
В этом смысле он превосходит пенициллин, который почти не активен к последним двум группам возбудителей инфекции. Особенно важным свойством стрептомицина является его высокая активность к возбудителю туберкулеза.

В своей структуре стрептомицин содержит (а) N-метил-Б-глюкозамин, (б) - стрептозу и (в) - стрептидин и является сильным органическим основанием. В практике применяют его соли с кислотами (соляной, серной и др.)

При культивировании стрептомицина в качестве источника энергии требуется быстро метаболизируемый сахар (например, глюкоза), который вводят в начале процесса. Однако скорость его ассимиляции должна быть строго ограничена количеством присутствующего азота и фосфата, что в противном случае приводит к чрезмерному росту мицелия и снижению выхода антибиотика.

На практике азот вводится в виде сложных соединений (фильтрат барды и остатки масличного семени), которые в течение длительного процесса ферментации медленно разлагаются, выделяя аммиачный азот, рН среды 7,0-8,0, температура ферментации ~28,5 С. На стрептомицин не действует ни пенницилаза, ни большинство микроорганизмов; если на более поздних стадиях процесса происходит инфицирование культуры, то образовавшийся стрептомицин не разрушается.

Типичные промышленные среды представляют смеси 2,5 %-й глюкозы, 4 %-й соевой муки с низким содержанием масла, 0,5 %-й барды и 0,25 %-й поваренной соли; в некоторых случаях добавляют сухие дрожжи, мясные экстракты и кукурузный экстракт. В процессе ферментации могут использоваться масла и жирные кислоты (в качестве питательных компонентов либо в качестве пеногасителей). Процесс ферментации развивается так же, как и в случае производства пенициллина, причем образование стрептомицина в течение первых трех дней не происходит. За 6 дней концентрация стрептомицина достигает конечной величины - 0,8 %.



Поскольку мицелий получается гораздо более мелкий, его нельзя собрать на волокнистом фильтре, поэтому для осветления субстрата используют кизельгур, в результате чего отфильтрованная масса делается пригодной для скармливания скоту. Субстрат разделяют на ионообменной колонне.

Получение тетрациклинов

В 1948 г. из почвы был выделен новый вид актиномицета -Streptomyces aureofaciens, образующий антибиотики - хлортетрациклин, тетрациклин и другие вещества:
В 1948 г. из почвы был выделен новый вид актиномицета -Streptomyces aureofaciens, образующий антибиотики - хлортетрациклин, тетрациклин и другие вещества
Как было найдено, эти антибиотики обладают широким антибиотическим действием в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, спирохет, хламидий и т. д. Их применяют в сельском хозяйстве как стимуляторы роста животных и птиц.

Хлортетрациклин был первым из выделенных тетрациклинов. В зависимости от свойств штамма в качестве источника энергии могут быть использованы различные углеводы, однако для промышленного производства представляют интерес лишь сахароза, крахмал и глюкоза. Максимальные выходы антибиотика достигаются в результате ограничения содержания неорганического азота в среде и заменой его сложными веществами биологического происхождения (мукой масличных семян, арахисом, копрой - ядром кокосового ореха).

В среду во многих случаях добавляют кровяную муку, рыбную муку и гидролизованный казеин. В ограниченных концентрациях используют кукурузный экстракт и барду при определенном содержании фосфатов. Содержание фосфатов является важным фактором, поскольку пока весь неорганический фосфат полностью не будет преобразован в нуклеиновые кислоты и другие продукты обмена, образование тетрациклина не происходит. Также в среде необходимо присутствие катионов микроэлементов (Со, Си, Zn, Mn, Fe).

Примерный состав питательных сред: крахмал (зерно в перемолотом и набухшем состоянии) 2-5 %, сахароза (в виде сахара или свекольной патоки) 1-3 %, мука из масличного семени (отходы с низким содержанием жиров, арахис или соя) 1-3 %, мясные отходы (кровяная или мясная мука) 0,2-0,5 %, кукурузный экстракт 0,2- 1,0 %, аммониевые соли 0,1-0,5 %, известь 0,5 %, поваренная соль 0,1-0,5 %, соли микроэлементов.

Для ферментации желательно применять ферментаторы, изготовленные из нержавеющей стали или другого стойкого материала. В течение четырех дней, пока длится процесс, среда должна аэрироваться. Окончательное значение выхода продукта приближается к 1 %. Препарат может быть осажден добавлением извести до рН 8,8. Затем он отфильтровывается на фильтр-прессе, экстрагируется разбавленной кислотой и очищается посредством фракционного осаждения: после перекристаллизации можно получить продукт, достигающий 98 % чистоты.

Окситетрациклин был впервые изготовлен в 1950 г. при культивировании актиномицета Streptomyces rimosus. Среда и условия ферментации подобны используемым при производстве хлортетрациклина, за тем исключением, что в качестве источника азота могут быть использованы нитраты и кукурузный экстракт.

Окситетрациклин образует нерастворимый комплекс с солями четвертичного аммониевого основания, и этот комплекс может быть легко отделен от субстрата, после чего его размягчают соляной кислотой и затем кристаллизуют в виде соли уксусной кислоты. Как и другие тетрациклины, этот препарат выпускается главным образом в виде таблеток или суспензии.

Тетрациклин был получен после хлортетрациклина и окситетрациклина, причем почти одновременно как путем направленной ферментации с помощью отобранных штаммов Streptomyces aureofaciens в условиях низкого содержания хлоридов в питательной среде, так и путем каталитического восстановления хлортетрациклина.

В методе направленной ферментации используется ряд организмов, в том числе и Streptomyces vicidifaciens, при этом полученный штамм в адекватной среде может обеспечить большие выходы тетрациклина или равные количества хлортетрациклина и тетрациклина пропорционально количеству присутствующих ионов хлора. В случаях, когда необходимо избежать образования хлортетрациклина, содержание хлорида в среде не должно превышать 17 ч./млн.

Если необходимо использовать в качестве основных компонентов субстрата сложные биологические вещества, то в условиях промышленного производства для контроля уровня хлоридов имеются два способа:
1) удалять большую часть хлорида, пропуская компоненты, такие, как сахар-сырец и кукурузный экстракт через ионообменные смолы. Этот метод вполне эффективен, если применяется к разбавленным растворам;

2) вводить в среду вещества, замедляющие утилизацию хлорида, например, бромиды. Оказалось, что при концентрациях от 10 до 350 ч./млн., ионы брома практически подавляют образование хлортетрациклина, даже в присутствии ионов хлора в концентрациях 1500 ч./млн. На практике применяют бромистый натрий (5 %).

Получение антибиотиков-макролидов

Большую группу антибиотиков (эритромицин, олеандомицин и др.), содержащих в своей структуре макроциклический лактонный фрагмент и продуцируемых различными штаммами Streptomyces., составляют так называемые макролиды.

Наиболее известным представителем этой группы является эритромицин, который по спектру антибактериального действия близок к пенициллину и применяется для лечения больных с повышенной чувствительностью к пенициллину и тетрациклину.
Наиболее известным представителем этой группы является эритромицин, который по спектру антибактериального действия близок к пенициллину и применяется для лечения больных с повышенной чувствительностью к пенициллину и тетрациклину
Культивирование продуцента эритромицина длится 150 часов при рН~7 на среде, приготовленной на основе крахмала, соевой муки, масла, кукурузного экстракта, сухих дрожжей и извести. Культуральную жидкость фильтруют на кизельгуре, и антибиотик экстрагируют с помощью амилацетата. Обычно фильтрат культуры и растворитель пропускают через установленный в системе смеситель, а затем через обычную центрифугу. Антибиотик можно разбавить буферным раствором, осадить ацетоном и хлористым натрием, и, наконец, кристаллизовать его из ацетонового раствора.

Широкое и успешное использование антибиотиков в медицине привело к их использованию и в других областях, в том числе:
- в ветеринарии (с теми же целями, что и в медицине);
- для борьбы с некоторыми болезнями растений бактериального и грибкового происхождения;
- в качестве добавки к кормам животных, так как они ускоряют рост и увеличивают степень превращения кормов в мясо;
- в качестве консервантов скоропортящихся продуктов;
- для подавления бактериальной флоры при осуществлении различных процессов при производстве вакцин.

Наука об антибиотиках продолжает быстро развиваться. С одной стороны, продолжаются поиски новых, еще более эффективных препаратов биотехнологии, в том числе с иммуностимулирующим, противоопухолевым, противовирусным действием, с другой стороны, расширяются работы по химическому синтезу производных этих веществ и химической модификации природных антибиотиков.

Продолжаются работы по созданию новых и совершенствованию действующих процессов биотехнологии, предусматривающих создание экологически чистых безотходных технологий.

Развитие исследований в этом направлении и внедрение их в практику является одним из перспективнейших разделов естествознания.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы