Генная инженерия. Биосинтез: мутации, адапторная функция т-РНК

25 Декабря в 9:46 2380 0


Мутации

Изменение структуры ДНК, передающееся последующим поколениям, называется мутацией. На молекулярном уровне мутация - это изменение нуклеотидной последовательности ДНК. В какой-то степени мутация - это спонтанный процесс, которому ДНК подвергается постоянно.

Причины мутаций различны:
1) связана с возможностью существования нуклеотидных оснований в двух таутомерных формах; предполагают, что в случае один на миллион возможно образование пар оснований и с таутомером;
2) действие продуктов нормального метаболизма клетки (пероксиды, азотистая кислота) - являются мутагенами, т. е. веществами, способными индуцировать химические мутации ДНК;
3) радиация. ДНК интенсивно поглощает УФ-излучение и при достаточной дозе это излучение убивает большинство клеток, а остальные подвергаются очень глубокой мутации (водородные связи заменяются на ковалентные). Однако каждая клетка имеет механизм для восстановления ДНК: с помощью ферментов она заменяет поврежденный фрагмент.

Мутации изменяют генетический материал клетки: возникают либо болезни, либо прекращается выработка какого-либо белка, либо просто активность белка уменьшается.

Спонтанные мутации появляются в результате ошибок репликации ДНК, неправильного формирования комплементарных пар оснований, структурных искажений ДНК и вследствие перемещения подвижных генетических элементов в процессе роста и размножения популяции бактерий. Спонтанные мутации могут обусловливать благоприятные и неблагоприятные генетические изменения.

Вероятность возникновения определенных мутаций в расчете на одну клетку и на одну генерацию называют частотой мутирования. При высоких скоростях роста она постоянна, и ее обычно определяют для клеток в экспоненциальной фазе роста при оптимальных условиях среды. В фенотипе проявляются не все мутации. Непроявленные мутации называются молчащими.

У мутанта может произойти обратная мутация, или реверсия, в результате которой восстановятся свойства дикого штамма. Об истинной обратной мутации говорят лишь в тех случаях, когда вторая мутация точно восстанавливает исходный генотип, если же восстанавливается только фенотип, то говорят о вторичной реверсии, или супрессорной мутации. Супрессорные мутации могут происходить как в исходном гене, так и в каких-либо других участках хромосомы (интрагенные и экстрагенные супрессорные мутации).

Индуцированные мутации возникают под влиянием внешних факторов, которые называют мутагенами. Мутагены бывают физическими (УФ-лучи, у-радиация), химическими (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, например, 2-аминопурин, азотистая кислота и ее аналоги, алкилирующие агенты и др.) и биологическими (транспозоны) (табл. 3.1).

По протяженности повреждений мутации бывают точечными, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженными (аберрации). Мутации разделяют на хромосомные, обусловливающие появление нового признака при изменении двух и более участков хромосомы, и генные, обусловленные появлением нового признака при изменении гена. В этом случае может наблюдаться модификации оснований (изменения отдельных нуклеотидов), выпадение нескольких пар нуклеотидов (делеции), перемещение группы нуклеотидов в пределах хромосомы (транспозиция), разрыв путем вставки посторонней ДНК (инсерция) или добавление нуклеотидных пар (дупликация) и деформация спирали ДНК. Для точечных мутаций частота реверсий довольно высока, в то время как для аберраций реверсии не характерны.

Первичный эффект мутагенного фактора не обязательно ведет к истинной мутации. Новый фенотип проявляется только тогда, когда измененный ген начнет функционировать. С помощью различных методов удается накапливать и выделять мутантов с разного рода дефектами: с нарушением процессов транспорта или использования субстрата, с дефектами промежуточного обмена, с повышенной чувствительностью к температуре и т. д.

Теоретически, мутации, вызванные радиацией, химическими веществами или другими факторами, могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, однако в любой живой клетке существуют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру ДНК. Совокупность ферментов, катализирующих реакции коррекции повреждений ДНК, составляют системы репарации, которые принципиально различаются по биохимическим механизмам восстановления генома.

Известны три основных механизма коррекции дефектов ДНК:
1. Непосредственная реверсия от поврежденной ДНК к исходной структуре.
2. Эксцизия («выпадение») повреждений с последующим восстановлением исходной структуры.
3. Активация механизмов, обеспечивающих устойчивость к повреждениям.

Реверсия повреждений ДНК. К механизмам прямой реверсии повреждений ДНК относится световая репарация, или фотореактивация (исправление деформации ДНК под действием УФ-лучей). Световая репарация осуществляется несколькими ферментами: фотолиазой (расщепляет тиминовый димер и восстанавливает целостность соседних тиминовых оснований), О6-метилтрансферазой (удаляет О6-метильную группу из остатков гуанина после действия метилирующих агентов), ДНК-пурин инсертазой (осуществляет встраивание утерянного при мутации основания в апуриновый сайт), ДНК-гликозилазой (удаление дефектных оснований). Все эти процессы происходят в один этап под действием конкретного фермента и безошибочно восстанавливают исходную структуру ДНК.

Системы эксцизионной репарации удаляют неправильно спаренные или поврежденные основания из ДНК и синтезируют новую последовательность ДНК, замещающую их. Место повреждения распознает эндонуклеаза, расщепляющая цепь ДНК вблизи дефекта, фрагмент удаляется, а дефект восполняется при помощи ДНК-полимеразы, которая проникает в брешь и встраивает в нее отсутствующие нуклеотиды, используя неповрежденную цепь ДНК в качестве матрицы. ДНК-лигаза ковалентно связывает 3'-конец вновь синтезированного участка ДНК с цепочкой.



Поскольку эта система репарации основана на ресинтезе нуклеотидной цепи на базе неповрежденной матрицы, она также является практически безошибочной.

Репарационные механизмы устойчивости к повреждениям ДНК. Кроме механизмов исправления повреждений, клетки имеют возможность «обойти» вызванную повреждениями блокаду репликации ДНК, например, путем репарации в процессе рекомбинации.

В биохимической технологии явление мутации важно с двух точек зрения:
1. С помощью мутаций можно изменить природу микроорганизма, чтобы от стал более полезным для какой-либо определенной цели. Например, основные успехи в производстве пенициллина были достигнуты благодаря получению высокопродуктивных мутантов исходного штамма плесени Penicillium путем его облучения ультрафиолетовым светом, что привело к увеличению выхода пенициллина (нужного продукта метаболизма) на несколько порядков (с 20 мг/л до 7 г/л). В дальнейшем при использовании других мутагенов (химических веществ, вызывающих мутации) производство пенициллина удалось увеличить до 20 г/л.

Таблица 3.1. Наиболее часто применяющиеся химические агенты для получения мутагенного эффекта
Наиболее часто применяющиеся химические агенты для получения мутагенного эффекта

2. С другой стороны, мутации могут создавать в биотехнологии и ряд затруднений. Для успеха микробиологического промышленного процесса часто необходимы чистые штаммы микроорганизмов, обладающие хорошо известными характеристиками. Вместе с тем нельзя исключать возможность мутаций в таких культурах, поэтому необходима регулярная проверка их генетической гомогенности.

Адапторная функция т-РНК

Между аминокислотами и нуклеотидами (или триплетами нуклеотидов) невозможны комплементарные взаимодействия по типу образования нуклеотидных пар А...Т, C...G, A...U. Поэтому было сделано предположение о существовании молекул-адапторов, каждая из которых может взаимодействовать с определенным кодоном, с одной стороны, и с определенной аминокислотой, с другой стороны.

В 1957 г. эти молекулы были обнаружены. Ими оказались транспортные РНК (т-РНК). Очевидно, что для адаптирования 20-ти разных аминокислот к соответствующим им кодонам нужно 20 разных т-РНК. Эти т-РНК обозначают следующим образом: т-РНКА1а т-РНКН1Я и т. д. (аланиновая т-РНК, гистидиновая т-РНК и т. д.). Однако, поскольку код вырожден, число разных т-РНК больше 20 (не меньше числа кодонов, имеющих смысл, т. е. не меньше 61-го).

Взаимодействие т-РНК с аминокислотами - ферментативный процесс, приводящий к образованию ковалентной связи между аминокислотой и т-РНК, катализируются эти реакции аминоацил-т-РНК-синтетазами. Такие соединения называют аминоацил-т-РНК (аа-т-РНК). Аминокислота присоединяется к 3'-концу нуклеотидной цепи т-РНК (где имеется последовательность А - С - С , общая для всех т-РНК), при этом образуется сложноэфирная связь за счет карбоксильной группы аминокислоты и гидроксильной группы концевого остатка адениловой кислоты в т-РНК:
образуется сложноэфирная связь
Существует не менее 20-ти разных аминоацил-т-РНК. Каждый из этих ферментов катализирует реакцию только одной из 20-ти аминокислот с т-РНК, соответствующей этой аминокислоте. Например, аланил-т-РНК-синтетаза катализирует реакцию аланина с аланиновой т-РНК: Аланин + т-РНКА1а+ АТФ = Ала-т-РНКА1а + АМФ + Н4Р2О7 Таким образом, аминоацил-т-РНК-синтетазы должны иметь в активном центре участок, комплементарный одной из аминокислот, и участок, комплементарный какой-то части молекулы одной из т-РНК.

Именно вследствие такой субстратной специфичности каждая из аминоацил-т-РНК-синтетаза «узнает» и «выбирает» из смеси 20-ти аминокислот и нескольких десятков т-РНК определенную пару (аминокислоту и соответствующую ей т-РНК), и соединяет эту пару.

Взаимодействие аа-т-РНК с кодоном и-РНК обеспечивается тем, что в одной из петель молекулы т-РНК имеется триплет нуклеотидов, комплементарный какому-нибудь кодону. Такой триплет называют антикодоном. Образование аа-т-РНК можно сравнить с изготовлением двойного шрифта, например, для перевода знаков азбуки Морзе в знаки буквенного алфавита:
Образование аа-т-РНК

Роль матричной РНК

Располагая двойным шрифтом, легко прочитать текст, записанный азбукой Морзе. Достаточно расставить шрифт на телеграфной ленте соответственно знакам азбуки Морзе. Роль и-РНК в трансляции аналогична роли телеграфной ленты в этом примере: аа-т-РНК присоединяется антикодонами к соответствующим кодонам и-РНК, в результате чего аминокислотные остатки оказываются расположенными в той последовательности, в какой расположены кодоны в и-РНК. Теперь остается лишь соединить аминокислотные остатки пептидной связью, чтобы получилась пептидная цепь (белок) с определенной первичной структурой.

Таким образом, последовательность кодонов и-РНК коллинеарна последовательности аминокислотных остатков в соответствующем белке. Эта схема отражает лишь принципиальный механизм перевода нуклеотидной последовательности (точнее, последовательности кодонов) в аминокислотную последовательность.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы