Биосинтез соматотропина и других гормонов человека. Получение интерферонов

25 Декабря в 11:18 4555 0


Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в головном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был выделен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке соматотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек.

Гормон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной карликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Исследования показали, что при внутримышечном введении соматотропина в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8-18 см в год.

Больные дети четырех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверстников к половой зрелости (14-16 лет). Если учесть тот факт, что из одного трупа можно получить 4-6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином - дело совершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и другие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала.

Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.

Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе кишечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образованием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 этапе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.

К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и тесты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадеживающими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.

Еще один гормон, в-эндорфин - опиат мозга, состоящий из 31-й аминокислоты, - был синтезирован в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн и американские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировали ДНК, кодирующую в-эндорфин, в клетках E. ooli и получили этот полипептид в виде слитного белка с ферментом в-галактозидазой. На первом этапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обратной транскрипции и-РНК, кодирующей в-эндорфин, и далее встраивали его в плазмиду E .coli за геном в-галактозидазы, при этом получили гибридный белок, состоящий из в-галактозидазы и в-эндорфина; далее ферментативно отщепляли в-галактозидазу, получая биологически активный в-эндорфин.

Получение интерферонов

Еще одним замечательным достижением генной инженерии является синтез интерферона.

Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, который выделяется в очень низких количествах клетками животных и человека при попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ними. Первые же исследования выявили высокую биологическую активность интерферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых заболеваний (подавляет размножение аномальных клеток).

Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны животных неактивны в организме человека и даже отторгаются им.

В организме человека вырабатывается несколько видов интерферонов: лейкоцитарный (а), фибробластный (Р) и иммунный (у) (Т-лимфоцитарный).

Природные интерфероны получают из крови человека с крайне низким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохранения в Хельсинки (в то время мировой лидер в получении лейкоцитарного интерферона) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0,1 г чистого интерферона.

Процесс получения интерферонов в основных чертах был одинаков для всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч фильтровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографической очистке.



Стоимость препарата была очень велика - 400 г интерферона стоил 2,2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологического его использования (в том числе против четырех видов рака) заставляла искать новые пути его получения, в первую очередь с помощью генной инженерии.

В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудность при этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало даже в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, что выходы были очень низкие: сообщалось о получении 1-2 молекул интерферона на одну бактериальную клетку.

В 1981 г. фирме «Генентек» удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую у-интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки млекопитающих, и они стали способными синтезировать интерферон с большим выходом - 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1 млн единиц интерферона (единица интерферона соответствует такому его количеству, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения вирусом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователи выделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили молекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далее были отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.

Получение иммуногенных препаратов и вакцин

Другая область применения генной инженерии связана с получением новых эффективных, безопасных и дешевых вакцин.

Вакцины - одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или опасных инфекционных заболеваний.

Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10-15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство принципиально новых вакцин.

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:
- живые аттенуированные вакцины;
- инактивированые вакцины;
- вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды);
- рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии

Технологию рекомбинантных ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленной мутации генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуно-генные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют иначе генными или генетическими.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий.

Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами:
- способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных протеинов;
- способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов;
- могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-лимфоцитов;
- способствуют формированию длительного иммунитета;
- устраняют риск инфицирования.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Похожие статьи
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы