Результаты изучения генов предрасположенности к ревматическим заболеваниям

21 Июня в 22:39 708 0


Результаты изучения аллельных ассоциаций маркерного GT повтора и РА выявили статистически значимое увеличение частоты носительства редкого аллеля Е1 среди больных РА с системными проявлениями по сравнению со здоровыми лицами. Показатель относительного риска (ОР) составил 3,9. Мы также изучили распределение аллельных вариантов динуклеотидного GT повтора среди больных системной склеродермией, анкилозирующим спондилоартритом и в контрольной группе здоровых индивидуумов. Среди больных ССД отмечались повышенная частота аллеля Е2 (ОР=3,22) и сниженная частота аллеля Е1 (ОР=0,3). Распределение аллельных вариантов GT повтора у больных анкилозирующим спондилоартритом статистически значимо не отличалось от такового в контрольной группе.

Сопоставимые с нашими данные были представлены Hall и соавт. Ими было получено также положительное значение лод-баллов (+0,65) для одного из маркеров TCRA локуса, расположенного в том же самом сегменте (q11) 14-й хромосомы, что и изученный нами локус TCRD. Помимо этого, Cornells и соавт. (1996) изучили ДНК полиморфизм V6, V7, V8 и V10 TCRA генов, кодирующих синтез вариабельного участка ot-полипептидной цепи Т-клеточного рецептора. Было выявлено увеличение частоты аллеля 2(+) V8 гена у больных РА. Значимость этой ассоциации была подтверждена на 2 других независимых европеоидных выборках. В совокупности эти результаты позволяют рассматривать хромосомный сегмент qll 14-й хромосомы как перспективный для дальнейшего поиска гена предрасположенности к РА.

Интересно отметить, что в этом же хромосомном сегменте локализованы ген серин-эстеразы 1, ассоциированный с цитотоксичностью Т-лимфоцитов (GZMB), ген матричной металлопротеиназы 14 (ММН14), ген транскрипционного фактора ингибитора каппа легких цепей В-лимфоцитов (NFkBI), локализованный в 14q12 хромосомном сегменте, определенная значимость которых в этиопатогенезе РА подтверждена последними исследованиями зарубежных авторов.

Другой возможный вариант трактовки полученных результатов: сами гены 8-полипептидной цепи Т-клеточного рецептора (TCRD) являются одними из генов предрасположенности к РА. В связи с этим представляют интерес некоторые особенности γ/δ Т-клеточного иммунитета, приведенные ниже.

1. γ/δ Т-лимфоциты в отличие от α/β Т-лимфоцитов негативны по CD4 и CD8, но так же, как и В-лимфоциты, позитивны по CD3. Однако CD3 сегмент δ-цепи более вариабельный, чем у иммуноглобулиновых цепей В-клеток.

2. Повышенное содержание γ/δ Т-клеток отмечено: а) при микобактериальных инфекциях (лепра, туберкулез), листериозе, стрептококковой и стафилококковой инфекциях и др.; б) при инфицировании вирусом Эпштейна—Барр, ВИЧ; в) при паразитарных инфекциях (лейшманиозе, шистосомозе).

3. Пул γ/δ Т-клеток подразделяется на две субпопуляции — V81 (негативные по CD45 RO) и V82 (позитивные по CD45 RO). Количество Vδ1 Т-клеток уменьшается с возрастом, тогда как количество Vδ2 Т-клеток увеличивается с возрастом. Блокада CD45 RO антигенной детерминанты моноклональным антителом предотвращает развитие аллергического энцефаломиелита в эксперименте.

4. Vδ1 Т-клетки распознают эндогенные антигены и белки теплового шока (Hsp). Показано, что микобактериальные Hsp являются суперантигеном для Vδ1 клеток. Отмечена положительная динамика у больных ЮРА при использовании в лечении белков теплового шока.

5. Показано, что в синовиальной жидкости больных РА во много раз повышено содержание Vδ1 Т-клеток. Отмечена аккумуляция Vδ1 Т-клеток при неспецифическом язвенном колите, аутоиммунном полигландулярном синдроме I типа. Повышенное содержание Vδ2 Т-клеток отмечено при рассеянном склерозе, атопическом дерматите. Увеличение концентрации γ/δ Т-клеток было выявлено у больных синдромом Дауна, у которых значительно чаще встречаются аутоиммунные заболевания, лейкемия и отмечается повышенная чувствительность к бактериальным и вирусным инфекциям.

6. Иммунный ответ к эндогенным антигенам γ/δ Т-клеток не ингибируется (в отличие от α/β Т-клеток) антителами против специфичностей I и II классов главного комплекса гистосовместимости. Эндогенные лиганды, индуцирующие аутореактивность Vδ1 клеток, остаются до конца не выясненными. Предполагают, что ими в первую очередь являются белки теплового шока. Аутореактивность реализуется только в присутствии лигандов к витронектиновому рецептору (VNR), относящемуся к группе мембранных рецепторов, включающих в себя рецептор фибронектина (FNR), IIb/IIIa рецептор тромбоцитов и др.

7. γ/δ Т-клетки-киллеры экспрессируют FcγRIIIa рецепторы. Показано, что полиморфизм FcyRIIIa гена по двум отличающимся друг от друга сайтам ассоциирован с чувствительностью к СКВ.

8. γ/δ Т-клетки обладают функцией надзора над опухолевыми клетками, они распознают клетки лимфомы Burkitt, трансформированные вирусом Эпштейна—Барр В-клетки, клетки лимфатической лейкемии и др. как в острой стадии, так и в стадии ремиссии.


Несколько отличный подход, базирующийся на данных об определенной гомологии структурных генов человека и мыши, был использован F.Tan и соавт. (1997) для выявления генов чувствительности к ССД. Ранее на инбредной линии мышей был выявлен на 15-й хромосоме участок, на котором идентифицирован ген фибриллина-1 (FBN-1), ответственный за детерминацию синдрома плотной кожи (tsk), моделирующего отдельные клинические проявления ССД у человека.

Затем с помощью ряда ДНК-маркеров был изучен аналогичный мышиному сегмент 15-й хромосомы человека на популяции американских индейцев Чоктау с высокой распространенностью ССД. Было показано, что ген чувствительности к ССД локализован на участке размером в 2 сантиморганиды 15-й хромосомы, содержащем порядка 40 генов, и что носительство определенных маркерных гаплотипов (39 % у больных против 7,8 % у здоровых) увеличивает риск развития ССД в 7,5 раз.

Аналогичная методология была использована для идентификации генов чувствительности к СКВ. Критический хромосомный участок, несущий ген или гены чувствительности к модельной СКВ, сначала был выявлен и локализован на 1-й хромосоме у инбредных линий мышей. Затем вся 1-я хромосома была прицельно протестирована у человека. Так, Tsao и соавт., использовав ДНК-маркеры и метод анализа сцепления, показали, что один из генов предрасположенности к СКВ локализован на участке протяженностью в 5 сантиморганид в сегменте q41—42 1-й хромосомы.

Следует подчеркнуть, что результаты получены на семьях, относящихся к различным расам, — европеоидам, азиатам, афроамериканцам, что подчеркивает универсальность действия этого гена предрасположенности в детерминации СКВ. Вклад этого гена в формирование подверженности к СКВ по предварительной оценке составляет около 20 %. В исследованиях G.Kearns и соавт. (1997) и K.Moser и соавт. (1997), проведенных на независимых выборках пораженных пар сибсов с использованием аналогичной методологии, была подтверждена локализация гена предрасположенности к СКВ в сегменте q41—42 1-й хромосомы, а также выявлены два других сегмента этой же хромосомы — q21 и q31—32, в которых могут быть локализованы гены чувствительности к СКВ.

Интересно отметить, что в сегменте q21—q23 1-й хромосомы локализованы гены экспрессирующихся на В-лимфоцитах Fc-рецепторов, полиморфизм которых ассоциирован с чувствительностью к СКВ. Так, Y.W.Song и соавт. (1997), J.T.Salmon и соавт. (1997) было показано, что Н/Н гомозиготы по 131-му аллелю FcyRIIa рецептора имеют в 3 раза меньшую вероятность заболевания СКВ. J.Wu и соавт. (1997) был изучен полиморфизм другого гена семейства Fc-рецепторов — FcyRIIIa. Было показано, что V/V гомозиготные носители аллеля 176 этого гена имеют в 2 раза меньший риск заболеть СКВ без нефрита.

Вероятность заболеть СКВ с развитием нефрита, для V/V гомозигот в 6 раз меньше, чем для носителей других генотипов этого гена. R.Mehrian и соавт. (1997) при изучении у больных СКВ ДНК полиморфизма гена интерлейкина-10 (IL-10), локализованного в q31—32 сегменте 1-й хромосомы и bcl-2 гена, локализованного в q21 сегменте 18-й хромосомы и ингибирующего апоптоз (запрограммированную смерть клетки), показали, что носительство аллеля 193 bcl 2-го гена и аллеля 127 IL-10 гена в раздельности умеренно повышает риск возникновения СКВ, тогда как их совместное наследование в 40 раз повышает риск развития этого заболевания.



Следует отметить, что на 1-й хромосоме также картирован ген Fas протеина (CD95), который в норме экспрессируется на мембране лимфоцитов и индуцирует апоптоз. Показано, что гены апоптоза обладают критическим регуляторным эффектом на иммунную систему. Инактивация или снижение регуляторной функции одного или более из этих генов может в части случаев вызывать аутоиммунное заболевание. Эти критические иммунорегуляторные гены получили название «аутогенов» по аналогии с онкогенами, классом нормальных клеточных генов, которые при утрате их функций обусловливают возникновение рака.

В настоящее время в ревматологии активно изучается полиморфизм некоторых генов апоптоза, таких как Fas, bcI-2, р53, c-fos, c-myc. Дефект апоптоза, связанный с аутоиммунитетом и обусловленный bcl-2 геном, был выявлен у мышей линии NOD, у которых развивается не только диабет I типа, но и поражение слюнных желез, сходное с таковым при болезни Шегрена. В ряде исследований было показано, что ген р53 суперэкспрессирован в синовии больных РА; в синовии и фибробластах больных РА выявлены соматические мутации р53 гена, которые обусловливают его аномальную функцию и как следствие — образование паннуса и костной деструкции. Мутации Fas-гена и как следствие этого аномальный синтез Fas-протеина выявлены в ряде исследований при СКВ и РА.

Интересный пример взаимодействия средовых и генетических факторов, связанный с нарушением функции аутогена, был найден у мышей инбредной линии 1рr, для которых характерно развитие системных аутоиммунных и лимфопролиферативных нарушений. Эти мыши являются носителями мутантного 1рr аллеля Fas-гена, кодирующего синтез Fas-протеина. У гомозиготных по мутантному аллелю мышей отсутствует экспрессия Fas-протеина, что приводит к дефекту апоптоза, к массивной аккумуляции лимфоцитов и развитию аутоиммунного заболевания.

Молекулярный анализ дефектного Fas-гена показал, что ген разорван вследствие встраивания в его кодирующую последовательность ретровирусного мобильного генетического элемента, известного как ЕТn. Таким образом, эта находка является первым примером более общего механизма, посредством которого ретровирусы и связанные с ними эндогенные последовательности могут нарушать иммунную функцию за счет изменения экспрессии аутогенов, одним из потенциальных результатов которой может быть аутоиммунное заболевание.

Другой генетический механизм нарушения иммунной функции, присущий ретровирусам, заключается в трансактивации иммунорегуляторных генов. Геномы всех ретровирусов человека обладают способностью кодировать синтез протеинов, которые воздействуют на LTR-промотеры вируса и стимулируют транскрипцию. Эти регуляторы носят название «трансактивирущие транскрипционные активаторы tat и tax» (tat у ВИЧ-1 и tax у HTLV-1 — вируса 1 Т-клеточной лейкемии человека). Хотя главная функция этих трансактиваторов — усиление транскрипции вирусного генома, выявлено, что эти протеины могут также усиливать транскрипцию определенных генов инфицированной клетки хозяина, одновременно репрессируя экспрессию других клеточных генов.

Так, было показано, что трансактивация с помощью ВИЧ-1-tat или HTLV-1-tax протеинов индуцирует активность части генов, таких как ИЛ-2, ИЛ-2 рецептор, гранулоцитомакрофагальный колониестимулирующий фактор, ИЛ-3, ИЛ-6, трансформирующий фактор роста β-1, продукты синтеза которых принимают участие в воспалительных реакциях. Недавние исследования на трансгенных мышах подтвердили правомочность модели ретровирусной индукции воспалительных заболеваний с помощью механизмов трансактивации. Группой исследователей на трансгенных по HTLV-I гену была смоделирована болезнь, тождественная синдрому Шегре-на. Другой группой исследователей были получены две линии, трансгенные по большому участку генома HTLV-1, содержащего env (envelope protein) и tax-гены. У этих мышей с высокой частотой отмечалось поражение суставов с образованием паннуса и эрозий, гистологически сходное с РА.

Помимо методологии сцепления, для выявления генов предрасположенности к РЗ широко используется и традиционный метод ассоциаций. Классический пример плодотворности этого подхода — идентификация антигенов и гаплотипов риска системы HLA для всех ревматических заболеваний, причем методами молекулярной генетики проводится изучение как самих генов (преимущественно II класса), так и их антигенов, что позволило сформулировать гипотезу «общего эпитопа». В то же время тот факт, что большинство носителей антигенов и гаплотипов риска не заболевают ревматическими болезнями, свидетельствует о наличии других генов чувствительности, не связанных с системой HLA.

Поэтому в последние годы в качестве генов-кандидатов предрасположенности к РЗ изучается полиморфизм других генов, продукты которых играют значимую роль в этиопатогенезе заболеваний, — генов интерлейкинов, факторов некроза опухолей и их рецепторов, металлопротеиназ, коллагенов, факторов роста и многих других. Так, T.Hohler и соавт. (1997) при изучении полиморфизма промоторной части гена фактора некроза опухолей (ФНОα) показали, что мутация в положении 238 у больных псориатической артропатией встречается в 32 % случаев по сравнению с 7 % в контроле (показатель риска GR-6,2).

В то же время исследования полиморфизма ФНОα у больных РА подобной ассоциации не выявили. S.John и соавт. (1997) с помощью ДНК-маркеров на пораженных парах сибсов изучили связь РА с генами интерферонов (ИФα, ИФβ, ИФγ), интерлейкинов (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6) и рецепторов интерлейкинов (ИЛ-IR, ИЛ-5R, ИЛ-8R). Более частое по сравнению со случайным совместное наследование общих аллелей среди пораженных пар отмечалось для ИФγ, ИЛ-5R и ИЛ-2, что свидетельствует о значимости аллельного полиморфизма этих генов в этиопатогепезе РА, особенно гена ИЛ-2.

Другим, активно развиваемым в последнее время направлением исследований в ревматологии является изучение полиморфизма регуляторных факторов, оказывающих влияние на экспрессию структурных генов К ним относятся системы гомеобоксов — повторяющихся последовательностей ДНК, кодирующих синтез тканеспецифических белков, которые способны связывать определенные участки ДНК, выполняя таким образом регуляторные и координирующие функции, а также транскрипционные факторы (вспомогательные белки, облегчающие РНК-полимеразам прохождение основных этапов транскрипции, а также обеспечивающие тканеспецифическую экспрессию структурных генов путем взаимодействия с их промотерами).

К числу транскрипционных факторов, изучаемых при ревматических заболеваниях, относятся AP-I (взаимодействующий с промотерами генов коллагена IV типа и стромелизина), сКРОХ (взаимодействующий с геном коллагена Al), IRF-1 (интерферон и NO-синтетазу регулирующий фактор), NF-kB и др. Семейство транскрипционных факторов NF-kB вовлечено в регуляцию выработки многих молекул иммунной системы, включая молекулы адгезии, ИЛ, ПГ, ФНО и др. На основании проведенных исследований было показано, что экспрессия NF-kB повышена в клетках синовии больных РА и псориатического артрита, что обусловливает повышенную выработку цитокинов и клеточную пролиферацию, т е NF-kB, являются одной из ключевых молекул в регуляции иммунного ответа.

Интересно отметить, что ингибиторы этих транскрипционных факторов (например, IkBa и др.) уменьшают воспаление и клеточную пролиферацию, поэтому NF-kB рассматривается как мишень для генотерапии аутоиммунных, в том числе и ревматических заболеваний. Значимость полученных в последние годы результатов по идентификации генов чувствительности к РЗ можно проиллюстрировать следующим примером: за рубежом в клиническую практику активно внедряются методы лечения, использующие принципы генотерапии, например лечение РА растворимым рецептором ФНО, рекомбинантным рецептором ИЛ-1, пептидами Т-клеточных рецепторов и др.

В заключение следует отметить, что в результате реализации международного проекта «Геном человека» к 2002 г. планируется картировать (т.е. локализовать на хромосомах) все 80 000 структурных генов человека, что существенно упростит поиск генов чувствительности болезней с наследственным предрасположением, в том числе и ревматических, так как не будет требовать проведения трудоемких семейных исследований. Прорыва в идентификации генов предрасположенности к ревматическим заболеваниям следует ожидать в ближайшие годы, хотя и в настоящий момент полученные в этом направлении результаты достаточно впечатляющие.

В.А.Насонова, Н.В.Бунчук

Похожие статьи
показать еще
 
Ревматология